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Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia PROFESOR PATROCINANTE: Marco Carmona B. INSTITUCIÓN: Instituto de Salud Pública de Chile PROFESOR CO-PATROCINANTE: Alejandro Jerez M. INSTITUTO: Farmacia FACULTAD: Ciencias “VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA LA IDENTIFICACIÓN Y VALORACIÓN DE CALCITONINA DE SALMÓN MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA” Internado presentado como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico. YENNIFER MARTIZA REYES FUENTES VALDIVIA-CHILE 2013 2 Agradecimientos A mis padres por ser el pilar en mi vida, gracias por confiar en mí y por entregarme los valores que me definen hoy como persona. A mi hermanita Fabi por ser mi incondicional, a mis abuelitos que amo tanto, ustedes son lo más lindo que tengo en la vida, gracias por existir. Al equipo trabajo de la sección Físico Químico del Instituto de Salud Pública, quiero agradecer por la colaboración y apoyo que me brindaron en mi internado, sobre todo a mi tutor Marco Carmona, pues sin su colaboración no lo hubiese logrado, han hecho que aprendiera mucho y me ayudaron en mi desarrollo profesional. A mis queridos amigos Mayela,Cristina, Joha y Victor por su amistad, cariño y apoyo; gracias por quererme y protegerme. Ignacio, gracias por tu amistad y por el apoyo que me diste cuando recién llegue a Santiago. A mi amado David, por ser incondicional, por ayudarme y apoyarme en todo este proceso. A mis queridos profesores Alejandro y Carolina, por tener siempre la disposición de colaborar en nuestro desarrollo profesional y por los consejos que siempre son bienvenidos. No puedo dejar pasar la oportunidad de agradecer al Dr. Humberto Dölz por su ayuda en todo mi proceso universitario, desde el comienzo, siempre le estaré agradecida y lo recordare con gran cariño. 3 ÍNDICE Resumen 9 Summary 10 1. INTRODUCCIÓN 11 1.1 Instituto de Salud Pública 11 1.2 Características generales de la molécula Calcitonina de salmón 13 1.3 Características de validación de métodos analíticos 15 1.4 Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) 21 1.5 Prueba de aptitud del sistema (system suitability test) 23 1.6 Parámetros de desempeño analítico 28 1.6.1 Linealidad y rango 28 1.6.2 Precisión 34 1.6.3 Exactitud 36 1.6.4 Límite de detección, Limite de cuantificación 38 1.6.5 Intervalo 38 4 1.6.6 Robustez 38 2. FUNDAMENTO DEL PROBLEMA 40 3. OBJETIVOS 41 3.1 Objetivo General 41 3.2 Objetivos Específicos 41 4. MATERIALES Y MÉTODOS 42 4.1 Instrumental y equipo 42 4.2 Reactivos 43 4.3 Preparación de muestras 44 4.4 Metodología analítica 45 4.4.1 Establecimiento condiciones cromatográficas 45 4.4.1.1 Preparación fase móvil 47 4.5.2 47 Validación del método analítico 4.5.2.1 Selectividad 48 4.5.2.2 Linealidad 49 4.5.2.3 Precisión 50 5 4.5.2.4 Exactitud 53 4.5.2.5 Intervalo 55 5. RESULTADOS 56 5.1 Validación de los métodos analíticos 56 5.1.1 Especificidad 56 5.1.2 Ensayo de Estabilidad 58 5.1.3 Linealidad 59 5.1.4 Exactitud 62 5.1.5 Precisión 65 5.1.6 Intervalo 70 5.2 Reporte de validación 70 6. DISCUSIÓN 71 7. CONCLUSIONES 74 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75 9. ANEXOS 78 6 ÍNDICE DE TABLAS Tabla N°1 Características de desempeño para la validación de métodos 17 analíticos Tabla N°2 Condiciones cromatográficas utilizadas en la validación 46 Tabla N°3 Preparación del nivel N°1 54 Tabla N°4 Preparación del nivel N°2 54 Tabla N°5 Preparación del nivel N°3 54 Tabla N°6 Resultados de especificidad 56 Tabla N°7 Resultados ensayo de estabilidad muestra de calcitonina de 58 salmón día 1 Tabla N°8 Resultados ensayo de estabilidad muestra calcitonina de salmón 59 considerando día 1y 2 Tabla N°9 Diluciones del estándar madre para ensayo de linealidad 59 Tabla N°10 Resumen curva calibración para estándar de calcitonina de 60 salmón Tabla N°11 Estadística de regresión para el ensayo de linealidad 61 7 Tabla N°12 Resultados para la solución estándar de trabajo correspondiente 62 al 65,2% Tabla N°13 Resultados para la solución estándar de trabajo correspondiente 62 al 65,2% Tabla N°14 Resultados para la solución blanco de trabajo de concentración 62 5,5UI/mL Tabla N°15 Tabla resumen para resultados de exactitud 63 Tabla N°16 El análisis estadístico del gráfico cantidad encontrada versus 64 cantidad agregada Tabla N°17 Resultados ensayo de repetibilidad para el nivel 1 65 Tabla N°18 Resultados ensayo de repetibilidad para el nivel 2 65 Tabla N°19 Resultados ensayo de repetibilidad para el Nivel 3 66 Tabla N°20 Resultados ensayo de precisión intermedia para el Nivel 1 66 Tabla N°21 Resultados ensayo de precisión intermedia para el Nivel 2 67 Tabla N°22 Resultados ensayo de precisión intermedia para el Nivel 3 67 Tabla N°23 Resultados comparación de medias para el Nivel 1 68 Tabla N°24 Resultados comparación de medias para el Nivel 2 68 Tabla N°25 Resultados comparación de medias para el Nivel 3 69 8 ÍNDICE DE FIGURAS Figura N° 1 Esquema sistema HPLC 22 Figura N° 2 Separación cromatográfica de dos picos 25 Figura N° 3 Anchura del pico cromatográfico 26 Figura N° 4 Asimetría del pico cromatográfico 27 Figura N° 5 Cromatograma del Solvente 57 Figura N° 6 Señal de Calcitonina 57 Figura N° 7 Gráfica concentración versus área de calcitonina de salmón 60 Figura N°8 Gráfica cantidad de estándar encontrado versus cantidad agregada 64 9 Resumen En el presente seminario se validó e implementó la metodología analítica por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), para el análisis de la molécula calcitonina de salmón, presente en un producto farmacéutico. El Instituto de Salud Pública, como ente referencial del país, compromete su capacidad técnica en desarrollar y mantener una política de calidad en base a los requerimientos de las buenas prácticas de laboratorio de la Organización Mundial de la Salud (BPL/ OMS) y la Norma Chilena NChISO 17.025, y ello lo hace bajo el trabajo del Subdepartamento Nacional de Control. Los parámetros de desempeño evaluados, basándose en el capítulo de Validación de Métodos de la USP XXXIV correspondiente a producto terminado o Categoría I, fueron: exactitud, linealidad, precisión, selectividad, linealidad e intervalo. Se estableció que el método validado cumple con los requisitos de linealidad en el rango del 16 al 180% de la concentración de trabajo (1,76-19,8 UI/mL); para la exactitud se trabajó con el porcentaje de recuperación, utilizando 3 niveles de concentración de trabajo 50, 100 y 150%. Se obtuvo un valor de recuperación entre el 85-115% del porcentaje de recuperación establecido en los criterios de aceptación. Se determinó que el método es preciso en el rango del 16 al 180% de la concentración de trabajo. El intervalo esta dado por el nivel correspondiente al 52,2% y el nivel superior de 121,0% que equivale a una concentración de 7,21 UI/mL y 16,76 UI/mL respectivamente. En la evaluación de la selectividad no se evidenciaron señales que se superpongan con la calcitonina. 10 Summary The present job deals with the validation and implementation of analytical methodology for the quantification of salmon calcitonin molecule by high performance liquid chromatography (HPLC). The Institute of Public Health as an entity of reference for the country, compromises their technical capacity to develop and maintain a quality policy based on the requirements of the Good Laboratory Practice of the World Health Organization (BPL / WHO) and the Norma Chilena NChISO 17.025. This objective is carried out through the work of the National Control Subdepartment. The analytical performance parameters evaluated were based on chapter Method Validation from USP XXXIV Class I finished products: accuracy, precision, selectivity, linearity and range. The validated method meets the linearity requirements in the ranges from 16% to 180% of the working concentration (1.76 to 19.8 IU/ml). Accuracy was evaluated by the recovery test, working at three concentrations levels: 50, 100 and 150% of the working concentration. The results obtained were between the 85-115% of the recovery percentage established in the acceptance criteria. It was determined that the method is precise through the study of repeatability and intermediate precision in the range of 16-180% of the working concentration. The range is between the 52.2% and 121.0% which equates to a concentration of 7.21UI/mL and 16.76 IU/mL respectively. The selectivity parameter did not shown any overlapping signals with the signal of Calcitonin. 11 1. Introducción 1.1 Instituto de Salud Pública El Instituto de Salud Pública de Chile (ISP), forma parte del sistema público de salud, siendo la institución de referencia nacional encargada de la normalización, fiscalización, vigilancia y calidad de laboratorios de salud pública, clínicos y ambientales, medicamentos, alimentos de uso médico y demás productos sujetos a control sanitario, garantizando a la ciudadanía su efectividad, calidad y seguridad (www.ispch.cl). La estructura organizacional del ISP está compuesta por la Dirección junto con sus Unidades Asesoras y los Departamentos del nivel operativo. El nivel operativo se compone de 4 áreas técnicas: Agencia Nacional de Medicamentos (ANAMED), Laboratorio Biomédico, Salud Ocupacional y Salud Ambiental, correspondiendo cada una de ellas a un departamento del nivel operacional. Además existe el área de apoyo que corresponde al departamento de administración y finanzas (Política de calidad ISP, 2009; www.ispch.cl). ANAMED está encargado de velar por el cumplimiento de la reglamentación vigente, así como verificar la ejecución del control y certificación de calidad de medicamentos, alimentos de uso médico, cosméticos y dispositivos de uso médico, comprometiendo su esfuerzo y capacidad técnica en desarrollar y mantener una política de calidad en base a los requerimientos de las Buenas Prácticas de Laboratorio de la Organización Mundial de la Salud (BPL/OMS) y la Norma Chilena NChISO 17.025, que permita realizar los controles de calidad a productos farmacéuticos y cosméticos registrados sanitariamente en el país de acuerdo a la normativa vigente (Política de calidad ISP, 2009). 12 El anexo 3 del informe 44 de la OMS, en concordancia con la normativa vigente en el territorio nacional, contiene las recomendaciones y requisitos que deben cumplir los laboratorios que serán considerados de referencia dentro de un país. Dicho documento plantea que todo laboratorio de control de calidad, deberá implementar un sistema de gestión que incluya el control del personal, infraestructura, equipos, reactivos, calibración, validación y verificación de quipos e instrumentos, la trazabilidad de los resultados y los procedimientos de trabajo, entre otros (Pérez et al, 2001; ICH Q2A, 2005). El Laboratorio Nacional de Control, perteneciente a la ANAMED, se encuentra organizado en tres aéreas de análisis: Laboratorio Físico Químico, Laboratorio Microbiológico y Sección de Pruebas Biológicas. A su vez, esta entidad trabaja en base a tres programas: Muestras Legales por Denuncia, Control de Estantería y Control de Serie. El Laboratorio Nacional de Control del Instituto de Salud Publica compromete su esfuerzo y capacidad técnica en desarrollar y mantener una política de calidad en base a los requerimientos de las BPL/OMS, que permita realizar los controles de calidad a productos farmacéuticos y cosméticos registrados sanitariamente en el país de acuerdo a la normativa vigente. Esta política establece la creación de procedimientos de operación para cada metodología utilizada y, por supuesto, la validación de éstas (Política de calidad ISP, 2009). El Instituto de Salud Pública, se ha propuesto como objetivo acreditar gran parte de las metodologías analíticas aplicadas en sus dependencias. A la fecha cuentan con 11 metodologías analíticas acreditadas por el INN, en función de la norma chilena NCh-ISO17025 “Requisitos Generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración”. La importancia de estas acreditaciones radica en la necesidad de demostrar la competencia técnica, la entrega de datos precisos y confiables y el fortalecimiento del ISP como entidad de referencia. 13 1.2 Características Generales de la molécula de calcitonina La calcitonina de salmón es un hormona polipeptídica de 32 aminoácidos (peso molecular aproximado 3500 Da) que tiene la misma secuencia de la hormona humana, encargada de regular el metabolismo del calcio dentro de nuestro organismo, la cual es sintetizada en las células C del tiroides (Lamprecht et al, 2004). Actualmente, se conoce la estructura de la calcitonina de 7 especies animales distintas (anexo 1). Las diferencias pueden ser grandes (hasta16 aminoácidos entre la humana y la bovina), pero 6 de los 7 residuos aminoterminales son constantes. Las formas más potentes son la del pez (salmón y anguila) y la del pollo. Se ha evidenciado que la calcitonina de pez es 20 veces más potente que la humana, motivo por el cual está siendo utilizada para uso terapéutico (Combe et al, 1997). La calcitonina se puede encontrar como un producto inyectable o spray nasal. La biodisponibilidad por vía intramuscular (IM) y subcutánea (SC) es del 70% y es en el riñón donde se produce la mayor parte de su metabolización. Por vía SC, la concentración máxima se alcanza a los 30 minutos y desaparece de la circulación en unas 12 horas. La semivida es aproximadamente de unos 30 min por vía Intravenosa (IV) y de 60-90 min por vía intramuscular. La vía nasal también es bastante utilizada a pesar de requerir mayor concentración para compensar su baja biodisponibilidad (un rango aproximado de un 3% comparado con la IV) (Flores, 1997; Martindale,2009). La calcitonina humana juega un rol fundamental en el metabolismo del calcio, al ser un potente inhibidor de la resorción ósea osteoclástica. Su efecto es reducir los niveles de calcio en la sangre, oponiéndose de esta forma a los efectos de la hormona paratiroidea, por lo tanto, el uso terapéutico de la calcitonina está dirigida al tratamiento de la osteoporosis (Silverman, 1997). Para ejercer esta actividad biológica existen tres características estructurales necesarias: un 14 puente disulfuro entre los residuos 1 y 7; ocho residuos de aminoácidos específicos en el extremo N-terminal y una amida prolina en el extremo C-terminal (D’ Hondt et al, 2010). Actualmente, sólo la calcitonina de salmón, de anguila y la porcina son aplicables para uso terapéutico. La calcitonina de salmón es una de las calcitoninas más usada, y posee aproximadamente 40-50 veces la actividad de la calcitonina humana (D’ Hondt et al, 2010). La calcitonina utilizada en los productos farmacéuticos, se produce por síntesis química o por procesos microbianos utilizando la tecnología de ADN recombinante (Lee et al, 2003). Al igual que cualquier medicamento, puede presentar efectos adversos. En la bibliografía se describen reacciones dermatológicas como rash cutáneo en cara o manos, reacción en el lugar de inyección; nauseas, rinitis, sinusitis; y reacciones de tipo inmunológico: reacción alérgica aguda y rara vez anafilaxis (Martindale, 2009). Dentro del arsenal terapéutico que existe en el país, se cuenta con productos que poseen calcitonina como principio activo en presentación de solución nasal para nebulización (Miacalic®, Calnisan®, Calcitonina de salmón). Al ser una molécula de origen biológico, la regulación sobre la misma es más estricta, por lo que está incluida en la nómina de productos a los cuales se les aplica control de serie. El control de serie es un conjunto de actividades de inspección y control oficial realizadas por el Instituto de Salud Pública, a un lote de productos farmacéuticos biológicos previo a su distribución y venta. Los aspectos analizados tienen como fin verificar el cumplimiento de las especificaciones del producto terminado, rotulado gráfico y condiciones en las cuales el lote se encuentra almacenado (Ministerio de Salud 2011). Dentro de la organización del Instituto de Salud Pública, la unidad responsable de llevar a cabo el control de serie es ANAMED. Para a esto debe contar con las técnicas de análisis adecuadas y 15 poseer la documentación que respalde la validez de las mismas, con el fin de asegurar la calidad de los productos farmacéuticos presentes en el país. 1.3 Características de la Validación de Métodos Analíticos La validación analítica se define como el establecimiento de la evidencia documentada de que un procedimiento analítico conducirá, con un alto grado de seguridad, a la obtención de resultados que sean precisos, exactos y dentro de las especificaciones y atributos de calidad previamente establecidos, demostrando además que el método es apropiado para las aplicaciones propuestas (Pérez et al, 2010; ICHQ2A, 2005). Para los métodos utilizados dentro del Laboratorio Nacional de Control, este proceso se realiza mediante estudios que permitan demostrar experimentalmente el cumplimiento de las especificaciones establecidas, basándose en documentos internacionales como la Farmacopea de los Estados Unidos (United States Pharmacopoeia, USP). Este texto define cuatro categorías de especificaciones y parámetros a determinar en función de la concentración de los analitos en la muestra, por lo que dependiendo de la categoría a la cual pertenezca, serán los parámetros a determinar para la validación de la técnica analítica. En conjunto con lo anterior, se pueden incluir parámetros que el laboratorio considere sean necesarios, según sus requerimientos internos (USP34, 2011). La Conferencia Internacional de Armonización (ICH), ente encargado de conciliar las diferencias que existen entre varios compendios regulatorios de la Unión Europea, Japón y Estados Unidos (ICHQ2A, 1995), emitió una guía en la cual se establecen los términos y definiciones para validaciones analíticas, así como también, la determinación de los requerimientos básicos. Entre estas se encuentran los distintos tipos de pruebas a realizar y el número mínimo de 16 determinaciones requeridas para cada uno de estos (Miller et al, 2005). La guía realizada por la ICH no establece necesariamente la forma de ejecutar la validación, sino que debe ser tomada como una base para dirigir su realización. Algunas de las principales razones que justifican la validación de un método analítico son (Pérez et al, 2010): 1. Es la herramienta con la que se obtienen las pruebas documentadas, para demostrar que los métodos utilizados son adecuados para los análisis propuestos en las condiciones que han sido descritas. 2. Permiten trabajar con métodos que ofrecen confianza y seguridad en los resultados obtenidos, minimizando el número de fallas y repeticiones, lo que trae consigo una reducción de los costos asociados. 3. No solo se conocerá el método analítico, sino que también se dará cumplimiento a las exigencias de las Buenas Prácticas de Laboratorio, con el fin de asegurar la calidad y eficacia del producto. 4. La validación es un paso o requisito previo de los procesos de transferencia de métodos analíticos. Como se mencionó con anterioridad, el desarrollo de la validación va a depender necesariamente del analito en cuestión. Es así como en la Farmacopea de los Estados Unidos se establecen categorías con diferentes esquemas de validación, para dar cumplimiento a una serie de requisitos presentados (USP 34, 2011): Categoría I: procedimientos analíticos para la cuantificación de los componentes principales de fármacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en productos farmacéuticos terminados. 17 Categoría II: Procedimientos analíticos para la determinación de impurezas en fármacos a granel o productos de degradación en productos farmacéuticos terminados. Estos procedimientos incluyen análisis cuantitativos y pruebas de límites. Categoría III: Procedimientos analíticos para la determinación de las características de desempeño (por ejemplo, disolución, liberación de fármacos). Categoría IV: Pruebas de identificación. En la tabla N°1 se aprecian los parámetros de desempeño analítico que se deben cumplir en cada una de las categorías de análisis, para demostrar la fiabilidad del método. Tabla N°1: Características de desempeño para la validación de métodos analíticos (USP 34, 2011) Datos requeridos para la validación Categoría I Categoría II Características de Desempeño Análisis Pruebas de Analítico Cuantitativos Límite Categoría III Categoría IV Exactitud Sí Sí * * No Precisión Sí Sí No Sí No Especificidad Sí Sí Sí * Sí Limite de Detección No No Sí * No Límite de Cuantificación No Sí No * No Linealidad Sí Sí No * No Intervalo Sí Sí * * No *Pueden requerirse, dependiendo de la naturaleza de la prueba específica. Cada laboratorio debe contar con un plan maestro de validación (PMV) el cual debe estar inmerso dentro del manual de calidad perteneciente al mismo. Este plan asignará las prioridades, 18 los responsables de la realización de este procedimiento y toda la documentación necesaria. La validación debe comenzar una vez que el método ya ha sido probado y ajustado. Aunque no existe un documento oficial que indique la secuencia que se debe seguir para el desarrollo de un método analítico, se suele dividir en cuatro fases (Pérez et al, 2010): 1. Definición de las características de practicabilidad: En donde se evalúan parámetros de desempeño del método, tiempo utilizado, costos asociados, calificación del personal, equipos e instrumental entre otros. 2. Estudios de Estabilidad de la muestra: Que debe realizarse durante el desarrollo del método, para demostrar estabilidad durante todo el periodo en que la muestra es preparada hasta que se realiza su análisis. 3. Características de Idoneidad: En esta fase se realizará la puesta a punto del método donde se definirán los parámetros para garantizar que el sistema responde al momento del análisis a los requisitos que se han fijado. Este ensayo se conoce comúnmente como System Suitability Test o Test de Idoneidad del Sistema, y se establece para cada procedimiento en específico (ICHQ2B, 1996). 4. Características de la Fiabilidad: Son las características que se deben analizar para demostrar que un método es apto para su aplicación rutinaria. En esta etapa se desarrollan los criterios fundamentales de la validación analítica y se evalúan los parámetros necesarios. Una vez definidos los pasos a seguir, el método es estandarizado realizando los ajustes y cambios que sean necesarios y se procede a realizar la validación siguiendo los siguientes pasos (Pérez et al, 2010): 19 1. Protocolos de Validación. El protocolo de validación corresponde a un documento que recoge el objetivo, la definición del sistema a validar, identificación de los parámetros, el diseño del plan experimental y los criterios de aceptación definidos por el laboratorio. Estos son específicos para cada producto y metodología, debiendo ser firmado y fechado por las personas responsables de la validación y revisados para la aprobación de esta por personal calificado (Pérez et al, 2010; Instituto Nacional de Normalización, 2001). 2. Validación y evaluación de resultados Analíticos. En cuanto a la realización de la validación, todos los datos y resultados obtenidos deben ser auditables y deben ser documentados de acuerdo al sistema de calidad. Cuando sean obtenidos los datos deben ser evaluados de acuerdo a los requerimientos internos del laboratorio y contrastados con lo establecido en el protocolo de validación. A su vez toda modificación posterior que se efectúe se deberá anexar, indicando los cambios y razones que lo justifican (Pérez et al, 2010). 3. Informe de Validación. El informe de validación realizada debe incluir (Pérez et al, 2010):  Referencia al protocolo, en el cual se describe el método y los procedimientos de cada uno de los parámetros que serán evaluados en la validación.  Los resultados de cada una de las determinaciones, incluyendo los datos primarios.  Referencias de calibración y calificación de instrumentos que fueron utilizados. 20  Discusión de los resultados y conclusiones obtenidas, en donde se indicará si el método es aceptado o rechazado, o si es aceptado pero con limitaciones. 4. Certificado de validación. Posterior a esto se formula el certificado de validación, que es el documento oficial que emite el laboratorio con los resultados obtenidos para cada parámetro, el cual debe ser revisado y firmado por las personas responsables y aprobado por la jefatura directa. Finalmente, se deben archivar los documentos obtenidos en la validación durante el tiempo en que determine el sistema de calidad del propio laboratorio (Pérez et al, 2010). 5. Revalidación. La revalidación de un método analítico corresponde a una repetición de la validación de forma parcial o total de un método. Una revalidación del método puede ser necesaria en los siguientes casos (Pérez et al, 2010; ICHQ2A, 2005; Procedimiento de validación, 2007):  Cambios en la síntesis de la droga en estudio.  Cabios en la composición del producto terminado.  Cambios en el procedimiento analítico.  Cambios en el equipo.  Transferencia del método interlaboratorio. En caso de que se presente alguno de los puntos citados anteriormente, se debe evaluar si realmente afectan la validación e idoneidad del método. 21 El Laboratorio Nacional de Control ha determinado que, todos los métodos validados deben ser revisados cada 5 años, para evaluar cualquier cambio significativo y demostrar que siguen siendo fiables para su uso, quedando todo esto, especificado en el informe de validación de la metodología analítica correspondiente (Miller et al, 2005). Unas de las técnicas utilizadas hoy en día es la cromatografía, este método permite separar, identificar y determinar ciertos componentes químicos que están presentes en mezclas complejas, siendo considerado uno de los métodos más potentes para producir separaciones (Quattrocchi et al, 1992). 1.4 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (High Performance Liquid Chromatography) El sistema cromatográfico consta de una serie de módulos que funcionan sincronizadamente para llevar a cabo el análisis. Por una parte, está el reservorio de la fase móvil que es uno o más recipientes que contienen los solventes necesarios para eluir la muestra dentro de la columna. Por otro lado el inyector es el componente encargado de tomar la muestra desde los viales para introducirlo en la columna. Ambas vías convergen en la bomba, que es la pieza donde se realiza la mezcla de la fase móvil con la muestra. Posterior a la bomba puede que exista un estabilizador de flujo para evitar complicaciones con la columna ya que el flujo de la fase móvil debe ser constante. Algunas metodologías incluyen una pre-columna para eliminar interferencias de las muestras a analizar. La columna cromatográfica es uno de los componentes principales del sistema ya que es aquí donde ocurre la separación de los analitos presentes en la mezcla en análisis. El relleno más común en la cromatografía se prepara con partículas de sílice las cuales se recubren con películas orgánicas que se enlazan química o físicamente a la superficie, otros materiales de empaquetamiento son las partículas de alúmina, polímeros porosos o resinas de 22 intercambio iónico. El tamaño de la partícula de relleno es importante porque controla el proceso de difusión de las moléculas de la muestra. Una vez sale la muestra de la columna pasa al detector, que es donde se evidencia la presencia del analito. Existe una amplia variedad de detectores: UV- visible, Arreglo de Diodos, Fluorescencia, Índice de Refracción, etc. La selección del detector dependerá de las propiedades fisicoquímicas de la o las moléculas que contenga la muestra. Un sistema cromatográfico puede contar con varios detectores acoplados seleccionando el que se utilizará según la necesidad (Quattrocchi, et al, 1992; Skoog et al, 2001). La señal química que se produce en el detector se transforma en señal eléctrica, la cual es recibida por el integrador. Es este último el que convierte esta información eléctrica en un cromatograma para poder analizarlo. Los equipos HPLC antiguos utilizaban un integrador que registraba en papel directamente el cromatograma. Los equipos más modernos utilizan programas computacionales que permitan el manejo de la información (Harvey, 2000). Figura N° 1: Esquema sistema HPLC 23 Para realizar un análisis por HPLC no basta con verificar el buen estado de los componentes del sistema; antes de ello, se debe demostrar que el sistema como tal funciona y permite obtener resultados analíticos fiables, dentro de ciertos parámetros establecidos. Para evaluar analíticamente el sistema cromatográfico se aplica una prueba de aptitud del sistema (System Suitability Test) la cual evalúa el trabajo de todos los componentes. Los parámetros mínimos que debe cumplir el sistema cromatográfico se encuentran definidos en la USP (Harvey, 2000). 1.5 Prueba de Aptitud (System Suitability) La prueba de aptitud del sistema, o Ensayo de Idoneidad del Sistema, es una parte esencial de muchos procedimientos analíticos. Esta prueba se basa en el concepto de que el equipo, los componentes electrónicos, las operaciones analíticas y las muestras que deben analizarse constituyan un sistema integral que puede evaluarse como tal (Pérez et al, 2001; Harvey, 2000). Los parámetros de la prueba de adaptabilidad del sistema que serán establecidos para un procedimiento en particular, dependen del tipo de procedimiento que se está validando. En algunas monografías de la USP se indican pruebas de desempeño que incluyen analitos de estructura relacionada con el principio activo, esta prueba se debe realizar antes de cada análisis y verificar si se cumplen los parámetros establecidos (Pérez et al, 2001). Los parámetros a considerar en HPLC: a. Factor de capacidad (k´): Término empleado para describir la migración de una partícula a través de una columna cromatográfica. Su valor numérico esta dado por: K´= ( tn-to ) to (Ecuación 1) 24 Donde tn es el tiempo de retención del pico del compuesto considerado y t o es el tiempo muerto (tiempo en el que el compuesto no retenido pasa por el interior del sistema). La medición de K´ es una operación muy frecuente, ya que su valor se emplea tanto para evaluar la retención como para ajustar la separación. El valor de K´ se regula entre 2 y 10 para mezclas de pocos componentes, o entre 0,5 y 20 si el número de analitos es grande o las condiciones cromatográficas no pueden ser optimizadas. b. Resolución (R): Mide la capacidad de una columna cromatografía de separar dos analitos (figura N°2). Se define como la diferencia entre los tiempos de retención de dos picos próximos dividida entre las anchuras promedio (Harvey, 2000): R = ( t2-t1 ) (Ecuación 2) ½(w2+w1) Donde: t2 y t1: corresponde al tiempo de retención de los picos de interés. w1 y w2: anchura de los picos de interés por tangente. Una resolución mayor a 1,5 permite una separación esencialmente completa de dos componentes ya que existe un solapamiento de los picos menor a un 0,3%. 25 Figura N° 2: c. Separación cromatográfica de dos picos Numero de platos teóricos (N): Es un indicador que mide la eficacia de un sistema cromatográfico. Se define como el número de picos que pueden aparecer en el cromatograma por unidad de tiempo, y por lo tanto, la capacidad del sistema para proporcionar bandas de elución estrechas. Su determinación se basa en la relación entre, el tiempo de retención y la anchura del pico cromatográfico (figura N°3), de acuerdo a las siguientes fórmulas: N= 16x (Rt/W)2 (Ecuación 3) Donde: Rt: El tiempo de retención del pico de interés. W: es el ancho del pico en su base, obtenido al extrapolar los lados relativamente rectos del pico hasta la línea base. N= 5,54 x (Rt/W0,5) Donde: Rt: Tiempo de retención del pico. (Ecuación 4) 26 W: Anchura del pico al 50% de su línea base. Los parámetros sobre los que se puede incidir para modificar el número de platos teóricos son la columna o soporte (longitud, calidad, tamaño de partícula) y las diversas condiciones cromatográficas definidas en el método (temperatura, flujo, fase móvil, etc.) (Pérez et al, 2001). El número de platos teóricos dependen del tiempo de elución pero en general se recomienda que sea superior a 2000, si es que la monografía no indica otra cosa. Figura N° 3: Anchura del pico cromatográfico d. Factor de asimetría o de cola (Tailing): El Tailing es una medida de la asimetría de la señal generada por el analito (figura N°4). El cálculo de la asimetría según farmacopea se realiza de acuerdo a la siguiente ecuación: T= W0,05/2F (Ecuación 5) Donde: W0,05: Anchura de pico al 5% de la altura del pico. F: Distancia entre la perpendicular trazada desde el máximo del pico y el frente al 5% de la altura del pico. La siguiente figura muestra una representación gráfica para el cálculo de la asimetría: 27 Figura N°4. Asimetría del pico cromatográfico. Un pico perfectamente simétrico tendrá un factor de simetría de 1,0. Un pico que presenta un ensanchamiento por el inicio (fronting) del pico tendrá valores inferiores a la unidad, mientras que si presenta cola (tailing) el factor de asimetría será superior a la unidad (Procedimiento de validación, 2007). Como norma general el factor de asimetría será superior a la unidad. Como norma general el factor de asimetría debería encontrarse entre 0,8 y 1,5, aunque pueden aceptarse valores de hasta 2,0, si es que la monografía no indica algo distinto (Pérez et al, 2001). e. Precisión del test de idoneidad del sistema: se evalúa mediante el cálculo de coeficiente de variación (CV) de los resultados obtenidos tras el análisis de una serie de replicados de una muestra. La USP 34 establece como criterio un coeficiente de variación igual o inferior al 2% en inyecciones replicadas 5 veces. En monografías individuales se acepta un CV menor o igual de 3% (USP34, 2011); si estos niveles no son establecidos el coeficiente de variación máximo será de un 2% para principios activos y para productos de degradación estará determinada por la ecuación de Horwitz (Horwitz, 1982): CV(%): 2(1-0.5logC) (Ecuación 6) 28 f. Límite de detección y cuantificación: Se considera dentro del test de idoneidad del sistema, ya que el analista tiene que evaluar si el instrumento a utilizar es lo suficientemente sensible para detectar las concentraciones de trabajo, cuando se trabaja con impurezas (USP 34, 2011). Para determinadas aplicaciones puede ser interesante el control de otros parámetros similares como el ruido de fondo y la deriva de la línea base, por ejemplo, para controlar la estabilidad de la temperatura, la mezcla de fase móvil, etc. (Harvey, 2000). Una manera rápida de determinar aproximadamente el límite de detección y cuantificación, es preparando una serie de diluciones del analito y evaluar la proporción señal/ruido; si se encuentra entre 3 y 10 estamos dentro del límite de detección y si es 10 estamos en el límite de cuantificación (Pérez et al, 2001; Harvey, 2000). 1.6 Parámetros de desempeño Analítico 1.6.1 Linealidad La linealidad se define como la capacidad que tiene un procedimiento para generar resultados de prueba que sean proporcionales, ya sea directamente o mediante transformaciones matemáticas bien definidas, a la concentración del analito en muestras, en un intervalo determinado (USP 34, 2011). Siempre que sea posible se buscará obtener una respuesta de este tipo, ya que de esta forma se facilitara su trazado, interpolación e interpretación (Pérez et al, 2001; Chan et al, 2004). La linealidad debe establecerse en el intervalo completo del procedimiento analítico, evaluando inicialmente la respuesta con un examen visual. La ICH y la USP, recomienda que se determine 29 linealidad en todos los métodos cuantitativos y que se consideren como mínimo los siguientes intervalos especificados (Pérez et al, 2001):  Específicamente para la valoración de un fármaco la concentración de trabajo debe estar entre un 80% a un 120%. Para evaluar la linealidad existe una serie de criterios aplicables a cualquier procedimiento: Se recomienda estudiar al menos 5 niveles de concentración y analizarlas por triplicado, dando un total de 15 determinaciones (Chan et al, 2004). Según los criterios utilizados por el laboratorio nacional de control ha determinado que los niveles a medir estén comprendidos entre 50% y 150% de la concentración de trabajo, incluyendo el 100% (Procedimientos de validación, 2007). Las muestras a analizar pueden prepararse a partir de estándares de analito de concentración conocida, o bien a partir de un lote de concentración conocida de la especialidad terminada (Pérez et al, 2001). Con los resultados obtenidos, se prepara una tabla que relacione las concentraciones “X” (variable independiente o predictiva) con la respuesta “Y” (variable dependiente, por ejemplo: áreas, alturas, absorbancias, etc.). La relación entre ambas se expresa matemáticamente como una ecuación de regresión lineal del tipo: y= bx + a (Ecuación 7) Esta ecuación es obtenida por un método de ajuste (por lo general el método de los mínimos cuadrados), siendo necesario en algunos casos aplicar alguna transformación matemática previa (logaritmos, recíprocos de las variables, etc.) para obtener una función lineal (Pérez et al, 2001). 30 a) Ecuación de la recta, pendiente y ordenada en el origen: En la recta de regresión = + , corresponde a la concentración, a la respuesta, el valor de la pendiente, que se encuentra relacionado con la sensibilidad del método, de modo que a mayor pendiente mayor sensibilidad, y el termino independiente u ordenada en el origen, es la intersección del eje de coordenadas con la recta y es indicativo de error sistemático, no difiriendo estadísticamente de cero en caso de no existir sesgo (Pérez et al, 2010). b) Coeficiente de correlación ( ) y coeficiente de determinación ( 2): El coeficiente de correlación nos indica, el grado de relación existente entre la variable (concentración) y la variable (respuesta), siendo su máximo valor 1. Cuando el valor se acerca a la unidad es significativo de que existe correlación con una alta probabilidad, mientras que el valor nulo indica ausencia de correlación entre ambas variables (Pérez et al, 2010). El valor recomendable para el coeficiente de correlación es ≥0,999, aunque para impurezas se puede admitir un valor ≥0,990. La información se obtiene del cálculo de es limitada y no justifica del todo la linealidad de los datos obtenidos, para esto se calcula el coeficiente de determinación 2 , el que proporciona un mayor grado de significación estadística, ya que su valor expresa la proporción de la variación total de c) explicada por el modelo (Pérez et al, 2010). Test de linealidad Para verificar la linealidad de una serie de datos existen varios procedimientos:  Coeficiente de variación de los factores de respuesta ( ): 31 El factor de respuesta, expresa la relación existente entre la lectura o respuesta obtenida (área) y la concentración, y puede tomarse como una expresión de la sensibilidad de calibrado. En una calibración lineal, los factores de respuesta deben ser semejantes entre si y cercanos al valor de la pendiente. Valores del coeficiente de variación mayor al 5%, indicaron una posible falta de linealidad, siendo recomendable un valor no mayor al 2% (Pérez et al, 2010). Para determinar el factor de respuesta se aplica la siguiente ecuación: (Ecuación 8) Donde se debe seguir el siguiente procedimiento:  Calcular para cada concentración  Determinar (promedio de los factores de respuesta) y (desviación estándar de los factores de respuesta).  Calcular el coeficiente de variación CV (%) de los factores de respuesta según la siguiente ecuación: (Ecuación 9) Donde: : Factor de respuesta. : Valores individuales de las áreas. : Valores individuales de las concentraciones. : Valor medio de los factores de respuesta. : Desviación estándar de los factores de respuesta. 32  Significación estadística de la desviación estándar de la pendiente: Se utiliza para comprobar que existe una pendiente significativamente distinta de cero, esto se calcula mediante la prueba de de Student utilizando la siguiente ecuación: (Ecuación 10) Donde se obtiene a partir del cálculo de la varianza residual 2 , La pendiente tiene que ser estadísticamente distinta de cero, para un grado de significación de = 0.05. También se puede calcular los intervalos de confianza a partir de la expresión: ± Donde * (Ecuación 11) es el valor de la distribución de Student para n-2 grados de libertad y un grado de significación de = 0,05. Los intervalos de confianza obtenidos no deberían incluir el cero. d) Test de proporcionalidad: Esta prueba permite evaluar si la recta pasa o no por el origen de coordenadas, determinando si la variable independiente es significativamente distinta de cero. Generalmente suele aceptarse que el valor de la ordenada, sea como máximo el que corresponde a un 1% de la respuesta de analito, a la concentración de trabajo del 100%( Pérez et al, 2001). Para determinar este valor se utiliza, al igual que en el test anterior, la prueba de significación de de Student (con n-2 grados de libertad y un grado de significación de = 0,05): exp= Donde (Ecuación 12) se obtiene a partir del cálculo de la varianza residual 2 . 33 En los intervalos de confianza debe estar incluido el cero. si el coeficiente de determinación r2< 0.9974 se hace prueba Student a dos colas con n-2 grados de libertad y un 95% de confianza. r x √(n-2) texp = √(1-r2) r= Coeficiente de Correlación. r2= Coeficiente de Determinación. n= Numero de niveles de la curva de calibración. (Ecuación 13) r= 0,9950 r2=0,9899 n= 5 Si el valor t experimental es mayor que el valor t de tabla se rechaza la hipótesis nula y se incluye que hay correlación entre X e Y. Ho= no existe correlación entre X e Y. H= existe correlación entre X e Y. En los casos donde no se cumple el test de proporcionalidad, en el cual el intervalo no incluye el cero, sería necesario interpolar el resultado de análisis de cualquier muestra en estudio entre al menos dos estándares, uno superior y otro inferior, con el fin de prevenir el sesgo del método (Pérez et al, 2001). 34 1.6.2 Precisión La precisión se define como, el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una serie de resultados obtenidos a partir de una misma muestra homogénea, en las condiciones inicialmente preestablecidas (USP 34, 2011). El objetivo de este estudio, es dar a conocer la variabilidad del método utilizado, la que se debe principalmente a errores aleatorios propios del método. Los principales factores que pueden influir sobre los resultados no siempre pueden ser controlados (tiempo, equipo, instrumental, analistas, reactivos, etc.) y aquí radica la importancia de este estudio (Pérez et al, 2001; Chan et al, 2004). Para el ensayo de precisión se pueden realizar diferentes tipos de estudios: a) Repetibilidad: La repetibilidad se refiere a la utilización del procedimiento analítico en un laboratorio durante un periodo de tiempo corto, realizado por el mismo analista y con el mismo equipo (USP 34, 2011; Chan et al, 2004). b) Precisión Intermedia: Expresa la variabilidad del método efectuando una serie de mediciones de una misma muestra, pero en diferentes condiciones de operación (diferentes días, analistas, equipos, etc.) y en un mismo laboratorio (Pérez et al, 2001; Chan et al, 2004). c) Reproducibilidad: Estudia la variabilidad del método en diferentes laboratorios y bajo condiciones de operaciones diferentes. La mayor parte de las veces, es utilizado como estudio de colaboración aplicado a la estandarización de nuevos métodos (USP 34, 2011). Generalmente el ensayo de reproducibilidad no se realiza en las metodologías utilizadas en el laboratorio nacional de control. Este estudio será necesario solo si se pretende efectuar el método en diferentes laboratorios o si se quiere normalizar el procedimiento, por ejemplo, para incluirlo 35 en alguna Farmacopea (Procedimiento validación, 2007). Por el contrario, el estudio de repetibilidad siempre es necesario y en este ensayo se medirá:  La repetibilidad del método, en donde se evaluara la variabilidad en la medición de una serie de tomas obtenidas a partir de una muestra homogénea, que se analiza independientemente, desde el principio hasta el final, por el mismo instrumento y el mismo analista (Pérez et al, 2001). Para estudiar la precisión de un método, se calcula generalmente el coeficiente de variación (CV) de una serie de mediciones utilizando la siguiente expresión matemática (Pérez et al, 2001). (Ecuación 14) Siendo: (Ecuación 15) Donde: : Desviación estándar. : Media aritmética de los resultados. : Valor obtenido del ensayo . : Número de determinaciones. De esta forma la ICH recomienda que, para determinar la repetibilidad del método, se evalúen una serie de muestras que cubran el intervalo especificado. Se deben analizar como mínimo tres 36 niveles de concentración que lo cubran y al menos tres determinaciones por cada nivel, o realizar como mínimo el estudio de 6 muestras a la concentración de trabajo (Pérez et al, 2001). 1.6.3 Exactitud: La exactitud de un procedimiento analítico es la proximidad entre los resultados obtenidos en una prueba mediante el procedimiento aplicado, y los resultados que son aceptados convencionalmente como verdaderos o de referencia (Procedimiento de validación, 2007; Chan et al, 2004). Según la guía Q2A de la ICH, la exactitud debe evaluarse en métodos de análisis para la valoración de materias primas y en productos terminados, y en métodos de análisis de cuantificación de impurezas. En la valoración de un fármaco, este parámetro se determina aplicando el procedimiento analítico, con respecto a un analito de pureza conocida (ejemplo: estándar de referencia) o comparando los resultados con un segundo procedimiento, cuya exactitud ya ha sido comprobada o se encuentra bien definida (Pérez et al, 2001). Para demostrar la exactitud se recomienda realizar un mínimo de nueve determinaciones en tres niveles de concentración del analito, que deben cubrir todo el rango especificado (Procedimiento de validación, 2007). Estas concentraciones pueden ser un nivel inferior, un nivel medio (correspondiente a la concentración de trabajo) y un nivel superior, que estén dentro de la linealidad del método (Pérez et al, 2001). La exactitud será expresada como, el porcentaje de recuperación en la valoración de una cantidad conocida de analito, la que es añadida sobre la muestra, o como la diferencia entre la media 37 obtenida y el valor aceptado verdadero, junto a sus respectivos intervalos de confianza. Esta será determinada utilizando la siguiente expresión (Procedimiento de Validación, 2007): (Ecuación 16) Diferencia: Xm – Donde: Xm : Valor medio hallado. : Valor aceptado como verdadero. También es posible realizar una comparación, frente al método propuesto para la determinación del analito, contra el valor teórico esperado (100%). Para ello se realiza la prueba de de Student de acuerdo a la siguiente ecuación (Procedimiento de validación, 2007): (Ecuación 17) Donde: 100 : constante. : Promedio de los porcentajes de recuperación. CV : Coeficiente de Variación de los porcentajes de recuperación : Número de experimentos. Para determinar la exactitud, se compara el valor de para n-2 grados de libertad y un grado de significación de =0,05. 38 1.6.4 Limite de detección, Límite de Cuantificación El Límite de Identificación (LoD, Limit of Detection) es una característica de las pruebas de límite y corresponde a la mínima concentración de analito que puede detectarse en una muestra, aunque no necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. Estas pruebas comprueban que la cantidad de analito se encuentra por encima o por debajo de un nivel determinado. Se expresa habitualmente en forma de concentración del analito. El límite de cuantificación (LoQ, Limit of Quantification), es una característica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se encuentran a baja concentración en la matriz de una muestra, tales como: impurezas en fármacos a granel o productos de degradación en productos farmacéuticos terminados. Es la mínima cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisión y exactitud aceptables en las condiciones experimentales indicadas. El límite de cuantificación se expresa habitualmente en forma de concentración de analito en la muestra (USP 34, 2011). 1.6.5 Intervalo o rango El intervalo de un método analítico es la amplitud entre la concentración inferior y superior del analito en la cual se puede determinar su valor, con un alto grado de precisión, exactitud y linealidad utilizando el procedimiento descrito. El intervalo quedará expresado en las mismas unidades que en los resultados de prueba obtenidos en el procedimiento analítico (Pérez et al, 2001). 1.6.6 Robustez La robustez de un método analítico es la medida de su capacidad para permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones en ciertos parámetros, proporcionando una idea de su 39 fiabilidad durante su empleo en rutina, o dicho de otra forma, es la capacidad que demuestra el procedimiento de análisis para proporcionar resultados válidos en presencia de pequeños cambios respecto de las condiciones descritas en el método, susceptibles de producirse durante su realización en el día a día (Miller et al, 2005). Estos cambios se pueden traducir en ligeras diferencias operativas, tales como cambio de equipo, analistas, columnas, laboratorios, reactivos, etc. Por lo general, las variaciones son realizadas una vez que se analiza todo el método, y es el equipo de trabajo quien define cuales son los factores que más pueden influir en la variación de resultados (Procedimiento de validación, 2007). La forma más práctica de analizar la robustez es mediante la aplicación de un diseño matricial, de esta forma es posible concluir, con un numero razonable de experimentos, cuales son las variables que más influyen en el método, sin realizar todas las combinaciones posibles (Pérez et al, 2001). 40 2. Fundamento del problema El Instituto de Salud Pública ente regulador y fiscalizador somete a análisis a todo producto considerado biológico, bajo el programa control de serie. Para cumplir con los estándares de calidad que ha definido el instituto de salud pública en base a normas internacionales, es necesario contar con metodologías analíticas fiables y seguras. Para llevar a cabo esto, el Subdepartamento Nacional de Control cuenta con un programa definido para validar las metodologías analíticas que utiliza y así asegurar la calidad y certeza de los resultados; el presente forma parte de este programa de validación y está basado en la identificación y valoración de calcitonina de salmón en solución nasal para nebulización. 41 3. Objetivos 3.1 Objetivo General Implementar y validar la metodología analítica para cuantificar calcitonina de salmón en el producto farmacéutico Miacalcic solución nasal para nebulización como parte del plan de trabajo del laboratorio nacional de control del Instituto de Salud Pública de Chile. 3.2 Objetivos Específicos  Establecer las condiciones óptimas de trabajo para el desarrollo de la validación de metodología para identificación y valoración de la calcitonina de salmón.  Estandarizar la metodología analítica para identificación y valoración de calcitonina.  Documentar el procedimiento de la metodología analítica según requerimientos del laboratorio nacional de control.  Confeccionar el protocolo de validación de metodología analítica para el laboratorio nacional de control.  Evaluar los parámetros de desempeño analítico de la metodología implementada o especificidad. o Linealidad e intervalo. o precisión. o exactitud.  Documentar mediante un reporte de validación de la metodología analítica y los resultados obtenidos según requerimientos de ANAMED. 42 4. Materiales y métodos 4.1 Instrumental y Equipo  Micropipetas Eppendorff: Volúmenes: 1000 L 5000 L  Materiales de Vidrio: clase A.  Probeta de 1000mL  Propipetas  Pipetas graduadas  Pipetas volumétricas  Matraces aforados  Espátula  Pinzas  Pizetas  Jeringas de vidrio (Hamilton)  Filtros micropore 0,22 m  Naves de pesadas antiestática  Papel para pesada antiestático  Viales HPLC, septas y tapas  HPLC (Cromatografía liquida de Alta Eficiencia) 1. Marca: Shimadzu 2. Módulos: 43 3.   Autosampler: Modelo SIL-20ACHT  Bomba : Modelo LC-20 AD  Detector con arreglo Diodos (512): Modelo SPD-M20A.  Horno: Modelo CTO-20AC. Softwere: LCsolutions Columna: Xterra, empacado RP18 (5 m tamaño de partícula) interno. Dimensiones: 4,6 mm de diámetro interno, 250 mm de longitud.  Balanza Analítica, Sartorius, modelo : CP 225D  Balanza Granataria, Sartorius, modelo:ED 124S  Equipo Sonicador Branson 8510 4.2 Reactivos:  Estándar Primario de Calcitonina de Salmón WHO/NIBSC 58/586  Hidróxido de Tetrametilamonio Pentahidratado grado analítico, Sigma Aldrich  Acetonitrilo calidad HPLC, Merck  Cloruro de Sodio grado analítico, Merck  Acetato de Sodio Pentahidratado grado analítico, Merck  Ácido Acético Glacial grado analítico, Merck  Ácido orto-fosfórico grado analítico, JT Baker  Agua desionizada grado HPLC 44 4.3 Preparación de Muestras.  Preparación de la solución diluyente (matriz de la muestra). Se disolvieron en 1000 mL de agua para HPLC, 7,5 gr de cloruro de sodio y 3,3 gr de acetato de sodio trihidratado, posteriormente se agregaron 2 mL de de ácido acético glacial, finalizando con la mezcla.  Solución stock. Se sacó 1mL de solución de Miacalcic® y se agregaron a un matraz de 10mL y se aforó con solución diluyente, obteniéndose una concentración de 13,8UI/mL.  Solución estándar: Se tomaron 3 ampollas de estándar calcitonina de salmón de 138 UI cada una, el polvo liofilizado se disolvió con 1mL de solución diluyente, esta solución se extrajo con una jeringa y se agrega a un matraz de 10mL, posteriormente se procede a aforar con solución diluyente. 45 4.4 Metodología Analítica El desarrollo del método para la identificación y valoración de la calcitonina de salmón en solución para inhalación por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), se realizó de la siguiente manera:  Establecimiento de las condiciones cromatografías  Validación del método analítico. 4.4.1 Establecimiento de las condiciones cromatográficas En base a las revisiones bibliográficas se analizaron métodos establecidos tanto en la Farmacopeas de los Estados Unidos como en la Farmacopea Británica, y en otros documentos que hacían alusión al desarrollo de una metodología analítica para la identificación y valoración de la calcitonina de salmón en solución para inhalación. Luego de realizar una serie de ensayos para lograr una separación adecuada de la sustancia de estudio, utilizando diferentes fases móviles, ocupando mezclas de solventes en gradientes de concentración y flujo, se evaluaron además, variaciones en los volúmenes de inyección, la temperatura y la longitud de onda. La elección de las condiciones cromatográficas se basó en los aspectos descritos en el test de idoneidad (USP34, 2011; Buck et al, 1990). Las condiciones cromatográficas utilizadas para la validación de la metodología analítica de la calcitonina de salmón se detallan en la tabla N°2. 46 Tabla N° 2: Condiciones cromatográficas utilizadas en la validación. Columna xTerra 4.6mmx25 cm; relleno C18 Tiempo FM A* FM B** 0 Fase móvil 72% 28% 0,01 35 48% 52% 35 35.01 72% 28% 72% 28% 45 Ajuste de pH 2.5 Velocidad de flujo 1mL/minutos Volumen de inyección 700 L Longitud de onda 220nm Temperatura de horno 65°C Tiempo de corrida 45 minutos FM A (fase móvil A) *: (9%acetonitrilo, 91%hidróxido de tetrametilamonio). FM B (fase móvil B) **: (60%acetonitrilo, 40%hidróxido de tetrametilamonio) Como parte del desarrollo del método, se realizó un estudio de estabilidad de la muestra a una concentración de trabajo y en condiciones comunes de almacenamiento dentro del laboratorio, utilizando el método estandarizado. El análisis fue realizado preparando un estándar de concentración 13,8UI/mL y realizando 5 lecturas por día (durante los cinco días que duro el estudio). Se determinó el coeficiente de variación (CV) de cada serie de inyecciones en forma individual y también de la serie de cada día respecto al resultado del día 1. Se definió como límite de aceptación un valor de CV menor a 5% para considerar que las muestras son estables durante diferentes días. La solución estándar se guardó bajo refrigeración, a una temperatura entre 2 y 8°C, y se dejó aproximadamente 60 minutos a temperatura ambiente previo al análisis de cada día. Los criterios 47 de estabilidad establecen que el coeficiente de variación calculado debe ser < 3% (USP34, 2011; Procedimiento validación, 2007). 4.4.1.1 Preparación de la Fase Móvil Fase móvil A: Se disolvieron 11,7527g de hidróxido de tetrametilamonio en 3600 mL de agua. A 2730 mL de ésta solución se le adicionaron 270 mL de acetonitrilo. Se ajustó a pH 2.5 con ácido orto-fosfórico al 0,2%. Se mezcló, filtró y desgasificó con un filtro de 0,22 m, utilizando el método al vacío. Fase móvil B: Se disolvieron 11,7527g de hidróxido de tetrametilamonio en 3600mL de agua. A 800 mL de ésta solución se le adicionaron 1200 mL de acetonitrilo, y se ajustó a pH 2.5 con acido orto-fosfórico al 0,2%. Finalmente, se procedió a mezclar, filtrar y desgasificar con un filtro de 0,22 m, utilizando el método al vacío. 4.5.2 Validación del método analítico Una vez que el método fue implementado y se establecieron las condiciones cromatográficas adecuadas, se procedió a realizar la validación de la metodología analítica. Para ello, se tomo como base, los parámetros de desempeño indicados en la USP que corresponde a la Validación de Procedimientos Farmacopeicos. Esta sección indica que la metodología seleccionada se encuentra dentro de la Categoría I, que corresponde a procedimientos analíticos para la cuantificación de los componentes principales de fármacos a granel o ingredientes activos en productos farmacéuticos terminados, recomendando la verificación del cumplimiento de los criterios para la selectividad, linealidad, precisión, exactitud e intervalo (USP 34, 2011; ICH Q2A, 1995). 48 4.5.2.1 Selectividad Se verificó la selectividad del método, estudiando la capacidad que tiene para detectar la molécula de calcitonina de salmón en forma inequívoca y sin interferencias de otras sustancias que pudiesen estar presente en la muestra, tales como componentes de la matriz de la muestra, impurezas pertenecientes al detergente o al proceso de lavado, o posibles productos de degradación al someter la muestra a condiciones de estrés, tales como: medio ácido, básico y oxidante (Pérez et al, 2001). Utilizando las condiciones cromatográficas establecidas en el desarrollo de la metodología, se realizaron una serie de lecturas de las siguientes soluciones, analizando cada una por triplicado (Chan et al, 2004; Pérez et al, 2001):  Muestra 1: lectura del solvente de la muestra (solución diluyente).  Muestra 2: lectura del solvente de la muestra con detergente de lavado. Se obtuvo una alícuota de 5mL de solución detergente de lavado de materiales, se añadieron a un matraz de 25mL y se eliminan enjuagando el material con agua purificada; luego se aforó el matraz con la solución diluyente y se procedió a la lectura de la muestra.  Muestra 3: lectura de solución estándar de calcitonina de salmón 13,8 UI/mL.  Muestra 4: lectura de la muestra de Miacalcic® (calcitonina de salmón) 13,8 UI/mL.  Muestras 5: lectura de la solución fue sometida a condiciones de estrés en medio ácido. A tres muestras de la solución estándar de calcitonina de salmón 13,8 UI/mL se adiciona HCl 0,1%. Las muestras se dejaron a temperatura ambiente, en matraces de color ámbar por 3 días y se procedió a la lectura de la muestra (Procedimiento de validación, 2007). 49 Para cada una de las lecturas se determinó la pureza del pico y el tiempo de retención mediante inspección visual del cromatograma y contrastando cada muestra en la señal correspondiente al estándar, a la concentración y condiciones de trabajo establecidas. Los criterios de aceptación utilizados para la selectividad fueron los siguientes (Procedimiento de validación 2007; USP34, 2011):  No se debe evidenciar ninguna señal significativa al tiempo de señal de la calcitonina de salmón.  La pureza de la señal debe ser mayor o igual al 99,0%.  La resolución entre la señal de calcitonina de salmón y los posibles picos generados por productos de degradación o contaminantes debe ser mayor o igual al 2%. 4.5.2.2 Linealidad Se verificó la linealidad del método, realizando una curva de calibración con una serie de 5 puntos y efectuando lecturas en triplicado de cada uno de las concentraciones en forma independiente. A partir de una solución madre de calcitonina de salmón de 82.8 UI/mL, se prepararon las diluciones para determinar el rango de linealidad. Estas corresponden a las concentraciones de 50, 75, 100, 125 y 150% de la concentración de trabajo realizada (Chan et al, 2004; Pérez et al, 2001; Ermer et al, 2005). Los criterios de aceptación utilizados para el parámetro de linealidad fueron (Pérez et al, 2001; Procedimiento de validación, 2007): 50  La linealidad se evalúa a través de la inspección visual del gráfico, de concentración del analito v/s la señal entregada por el equipo HPLC.  El coeficiente de determinación debe ser mayor a 0,995, en caso de no cumplir se aplica el estadístico de de Student a dos colas con n-2 grados de libertad y un 95% de confianza, si el valor de experimental es mayor que el valor de de tabla se concluye que hay correlación lineal.  Se evalúa el coeficiente de variación del factor de respuesta (FR) el cual debe ser menor al 5% para todos los puntos.  El intervalo de confianza del intercepto del eje “y” debe incluir el cero. En caso de que no se cumpla este parámetro se evaluara estadísticamente mediante test de Student para concluir si se acepta o rechaza el resultado. 4.5.2.3 Precisión Se verificó la precisión del método, estudiando la repetibilidad y la precisión intermedia. Para ambos ensayos se realizaron una serie de tres repeticiones, para tres niveles de concentración contenidos dentro del rango de linealidad. Los niveles con que se trabajo corresponden al 16, 100 y 180% de la concentración de trabajo utilizada. En el caso de la repetibilidad, para cada nivel de concentración se prepararon las soluciones con pesadas independientes, pero bajo las mismas condiciones de laboratorio. Las soluciones para cada uno de los niveles de concentración, se procesaron el mismo día, por un mismo equipo y por un único analista. Para la precisión intermedia, se utilizan las mismas condiciones experimentales de la repetibilidad, ya sea en relación a la preparación de la muestra, equipo de 51 medición y analista, varía sólo el día en que se efectúa el ensayo (Chan et al, 2004; Pérez et al, 2001; Ermer et al, 2005). Los criterios de aceptación utilizados para el parámetro de precisión se definen a continuación (Pérez et al, 2001; Procedimiento de Validación, 2007):  Para la repetibilidad y la precisión intermedia, el coeficiente de variación de las áreas obtenidas no debe ser mayor al 3%.  Para la evaluación de resultados que se obtienen en el ensayo de la precisión intermedia, se aplica el “test de comparación de medidas”, con el fin de evaluar errores aleatorios en el conjunto de datos, esto se realiza siguiendo los siguientes pasos (Procedimiento validación 2007; Miller et al, 2002): 1. Comparación de varianzas: para probar si existe diferencia significativa entre dos varianzas se calculan los cuadrados de desviación estándar, y se aplica el test estadístico de Fisher ( ) a dos colas. Donde: 2 : Varianza mayor. 1 2 2 : Varianza menor. De modo que siempre 1. Posteriormente se compara el valor de crítico obtenido de tablas, para un nivel de significación de calculado con el valor = 0,05, con n-1 grados de libertad, para la varianza del numerador y n-2 para la varianza del denominador (Pérez et al, 2001). 52 Si crítico es mayor que el calculado, entonces se concluye que no existe una diferencia estadísticamente significativa entre las varianzas de los conjuntos de los datos, con lo cual se puede calcular una varianza común ( 2 común). 2. Determinar la varianza común: si se comprueba que ambas varianzas son estadísticamente iguales, debe calcularse la varianza conjunta, que corresponde a una estimación de la varianza común entre los dos conjuntos de datos. (Ecuación 17) 3. Comparación de medias: Esta prueba permite ver qué sucede con la hipótesis que afirma, la inexistencia de diferencias significativas, entre las medias aritméticas (el promedio x 1 y x2). Se realiza el test de Student de acuerdo a la siguiente expresión: (Ecuación 18) Se calcula el valor de experimental y se compara con el valor de critico, para un nivel significación =0,05 y (n1+n2)- 2 grados de libertad. Se comprueba que no existe diferencia significativa, entre las medias aritméticas de ambos conjuntos de datos, si experimental crítico. 4. Si no se cumple la condición de homogeneidad, es decir estadístico de Cochran, que se basa en comparar el valor de ’ dado por la siguiente expresión: , se aplica el test de experimental con el valor de 53 (Ecuación 19) Donde: 1: 2: Si Valor critico para Valor critico para con n1 - 1 grados de libertad (obtenido de tabla). con n2 - 2 grados de libertad (obtenido de tabla). experimental < | ’| se concluye que las medidas de ambos conjuntos de datos son significativamente iguales. 4.5.2.4 Exactitud Se verificó la exactitud dentro del rango de trabajo especificado para la linealidad, y para su ejecución se prepararon 3 niveles de concentración los que corresponden al 70, 100 y 150% de la concentración de trabajo, realizando tres lecturas para cada uno (Pérez et al, 2001, Chan et al, 2004; Ermer et al, 2005).  Se preparó una solución estándar de calcitonina de salmón a una concentración 27,6 UI/mL equivalente al 200% de la concentración de trabajo, en base a esta solución se realizan los análisis.  Se preparó un blanco, tomando una cantidad de muestra representativa del producto en estudio. Se tomó 1 frasco ampolla de 1mL de calcitonina de salmón 2200 UI/mL y se llevó a un matraz de 10mL, dando una concentración 220 UI/mL, de esta solución se tomó una alícuota y se preparó un blanco de trabajo a una concentración de 5,5 UI/mL. De esta solución se realizaron tres lecturas (Procedimiento de validación, 2007). 54  Se prepararon dos estándares de trabajo de los extremos inferior y superior a la concentración de trabajo es decir que contempla el 70% y el 160% de cada concentración de la solución preparada se realizan 3 lecturas (Procedimiento de validación, 2007).  Se prepararon tres soluciones a tres niveles de concentración: N1 (inferior), N2 (medio) y N3 (superior), a continuación en las tablas N°3, 4 y 5 se detalla el procedimiento utilizado para la preparación de éstas (Procedimiento validación, 2007): Tabla N°3: Preparación del nivel N°1 Nivel 1 (estándar + blanco de trabajo)= 65,2% A una alícuota de 0,334 mL de estándar se le agregan 0,125 mL de solución blanco madre obteniendo una concentración combinada de estándar y blanco de aproximadamente 65,2% de la concentración de trabajo. Concentración Final Estándar + Blanco Nivel 1: 4.4601 UI/mL Concentración final estándar Nivel 1: 1,7101UI/mL Tabla N°4: Preparación del nivel N°2 Nivel 2 (estándar + blanco de trabajo)= 100% A una alícuota de 1,1mL de estándar se le agregan 0,125 mL de solución blanco madre obteniendo una concentración combinada de estándar y blanco de aproximadamente 100% de la concentración de trabajo. Concentración Final Estándar + Blanco Nivel 2: 8,3820 UI/mL Concentración final estándar Nivel 2: 5,6320 UI/mL Tabla N°5: Preparación del nivel N°3 Nivel 3 (estándar + blanco de trabajo)= 150,1% A una alícuota de 2,20 mL de estándar se le agregan 0,125 mL de solución blanco madre obteniendo una concentración combinada de estándar y blanco de aproximadamente 150,1% de la concentración de trabajo. Concentración Final Estándar + Blanco Nivel 3: Concentración final estándar Nivel 3: 14,0140 UI/mL 11,2640 UI/mL 55  A las lecturas de las soluciones de cada nivel (estándar más blanco de trabajo) se le sustrajo la lectura realizada al blanco de trabajo, obteniéndose de esta manera la lectura que es generada por el estándar que es adicionado a cada nivel (Pérez et al, 2001; Ermer et al, 2005). Los criterios de aceptación utilizados para el parámetro de exactitud fueron los siguientes:  La exactitud intra e interensayo expresada como error relativo porcentual (ER%) debe estar comprendida entre un + 15% de la concentración teórica para las concentraciones baja, media y alta (Pérez et al, 2001).  Interpretación estadística de la exactitud (Procedimiento de validación, 2007):  La exactitud se informa como el porcentaje de recuperación mediante la determinación de una cantidad agregada y conocida de analito para cada una de las muestras N 1, N2 y N3.  Para analizar cantidades conocidas del estándar añadidas al blanco de trabajo se realiza un cálculo de recuperación, en el que se compara las cantidades teóricas agregadas con los valores determinados, se grafica la masa encontrada en el eje “x” contra la masa agregada en el eje “y”. La ecuación de regresión lineal y sus estimadores se determina por el método de los mínimos cuadrados. El coeficiente determinación (r 2) debe ser mayor o igual que 0,995 y la pendiente tiene que ser mayor o igual a 0,95 (procedimiento de validación, 2007). 4.5.2.5 Intervalo o rango La determinación del intervalo se estableció una vez determinado los parámetros de linealidad, precisión y exactitud. Se expresó en las mismas unidades de trabajo obtenidas mediante este método analítico, que para este análisis fue en UI de calcitonina de salmón por mL de solución (Procedimiento de validación, 2007; Pérez et al, 2001; Chan et al, 2004). 56 5. Resultados 5.1 Validación de la metodología analítica 5.1.1 Especificidad A las diferentes condiciones de estrés que fueron evaluadas, no se observó interferencia con la señal analítica de calcitonina (tiempo de retención 19 - 21 minutos aproximadamente). Los resultados obtenidos se expresan en la siguiente tabla: Tabla N°6: Resultados de especificidad. Muestra Señal Tiempo de retención (min) Solvente 1 6,994 73435 Solvente + 1 6,997 74112 detergente 2 28,654 41.653 13690 1 6,987 --------- 77655 2 7,875 1,778 6469 3 18,38 17,561 20073 4 19,642 2,211 321531 5 28,609 15,552 34783 1 6,991 --------- 76377 2 7,895 1,8 8131 3 19,858 22,056 492058 4 28,64 15,134 11072 1 6,991 -------- 87229 Muestra 2 7,917 1,938 5173 degradada 3 11,226 8,746 5926 4 19,848 18,009 443441 Estándar Resolución Área Miacalcic recién Preparada 57 Figura 5. Cromatograma del Solvente Figura 6. Señal de Calcitonina 58 5.1.2 Ensayo de Estabilidad La evaluación de las muestras reveló que éstas son estables durante el día en el cual fueron preparadas. El estándar de solución para la valoración de calcitonina de salmón tiene una concentración de 0,054384mg/mL, cumple con los criterios de aceptación sólo el primer día de su preparación, cuando es almacenado bajo refrigeración a una temperatura entre los 2 y 8°C y dejado aproximadamente 60 minutos a temperatura ambiente previo a su análisis. También se pudo apreciar que no puede llevarse a cabo el análisis de las muestras en diferentes días, aún cuando se conserven bajo condiciones de refrigeración. Las tablas siguientes muestran los resultados de la evaluación de este parámetro los días 1 y 2 mientras que los resultados de los días siguientes días se detallan en los anexos. Tabla N°7: Resultados ensayo de estabilidad muestra de calcitonina de salmón día 1: Nº inyec tiempo de retención (minutos) 1 21,712 2 21,675 3 21,676 4 21,675 5 21,64 Promedio DE % CV Área 1137240,0 1136457,0 1129339,0 1124776,0 1056804,0 1116923,2 34001,76 3,0 59 Tabla N°8: Resultados ensayo de estabilidad muestra calcitonina de salmón considerando día 1 y 2: Día Nº inyec tiempo de retención (minutos) área 1 21,712 1137240 2 21,675 1136457 1 3 21,676 1129339 4 21,675 1124776 5 21,640 1056804 1 21,875 1501760 2 21,866 1502440 2 3 21,842 1498960 4 21,838 1501280 5 21,843 1499480 Promedio 1308853,60 DE 203580,79 % CV 15,55 5.1.3 Linealidad En las siguientes tablas se presentan los resultados obtenidos al evaluar este parámetro. La taba N°14 indica las concentraciones de los 5 puntos utilizados durante la determinación de la linealidad. Tabla N°9: Diluciones del estándar madre para ensayo de linealidad. Solución Alícuota 1 2 3 4 5 0,420 0,625 0,833 1,057 1,250 Volumen final a 5 mL a 5 mL a 5 mL a 5 mL a 5 mL Concentración final UI/mL 6,95520 10,35000 13,79448 17,50392 20,70000 60 Cada solución se analizó en triplicado, y los resultados promedio obtenidos se resumen en la Tabla N°10. Tabla N°10: Resumen curva de calibración para estándar de calcitonina de salmón. Solución 1 2 3 4 5 Concentración 6,95520 10,35000 13,79448 17,50392 20,70000 Área 205947,67 320054,67 529425,67 763120,00 885403,67 CV% 2,16 0,69 2,24 0,39 0,21 Criterio de aceptación CV de cada nivel < 3,0 % Cumple A continuación, se presentan los resultados de la inspección visual de la gráfica de concentración versus área entregada por el equipo HPLC (Figura N°8) y la interpretación estadística de los resultados (tabla N°11). Figura N° 7: Gráfica concentración versus área de calcitonina de salmón. 61 Tabla N°11: Estadísticas de regresión para el ensayo de linealidad. Estadísticas de regresión Calificación Coeficiente de correlación (r) 0,99496 No cumple Coeficiente (r2) 0,98994 No cumple Error típico S y/x 0,3322 N° Determinaciones 5 Pendiente 0,5210 Intercepción eje Y -1,8130 Desviación estándar del 0,2175 intercepto Sa (eje Y) T student (n-2) 3,1824 + Valor Min Valor Max Intervalo confianza del intercepto eje Y 0,6920 -2,5050 -1,1209 No Cumple: Intervalo de confianza del intercepto no incluye el cero. Tomando en consideración que los resultados obtenidos no cumplen con el parámetro referente al coeficiente de variación del factor respuesta y tampoco con el criterio del coeficiente de correlación se decidió aplicar el test de Student con el fin de evaluar la significación estadística de estos resultados, Prueba t Student t experimental t de tabla Calificación 3 17,1854 3,1824 Cumple Aplicando el test de Student se demostró que la metodología cumple con el parámetro de linealidad. 62 5.1.4 Exactitud Los resultados obtenidos de las lecturas de las soluciones estándar de trabajo y el blanco, se presentan a continuación en las Tablas N° 9,10 y 11 respectivamente. Se apreció que a los tres niveles evaluados la técnica cumplió con los límites establecidos para este parámetro. Tabla N°12: Resultados de la solución estándar de trabajo correspondiente al 65,2% Nº inyec 1 2 3 Tiempo de retención 21,608 21,608 21,629 Asimetría 1,176 1,184 1,168 Promedio DE % CV Área 277942 277625 279060 278209,0000 753,84 0,27 Tabla N°13: Resultados de la solución estándar de trabajo correspondiente al 150,1% N° inyec Tiempo de retención Asimetría Área 1 21,598 1,148 704052 2 21,583 1,159 707107 3 21,579 1,239 708288 Promedio 706482,3333 2186,00 DE 0,31 % CV Tabla N°14: Resultados de la solución blanco de trabajo de concentración 5.5 UI/mL. N° inyec Tiempo de retención Asimetría Área C muestra UI/mL 1 21,692 1,177 208697 7,9649 2 21,684 1,189 208330 7,9545 3 21,712 1,186 208496 7,9592 7,9596 Promedio 208508 183,78 0,01 DE 0,09 0,07 % CV 63 En la siguiente tabla se presentan los valores de los tres niveles de concentración N1 (inferior), N2 (medio) y N3 (superior) utilizados para evaluar la exactitud. Tabla N°15: Tabla resumen para resultados de exactitud. C UI/mL C UI/mL UI % estándar estándar estándar estándar Agreg. Encont. encontrado encontrado 1,7101 1,9168 5,632 6,0807 11,264 12,8803 1,9104 1,9188 1,9211 6,0781 6,0833 6,0806 12,8797 12,8747 12,8865 Promedio DE CV 111,72 112,21 112,34 107,92 108,01 107,96 114,34 114,3 114,4 111,47 2,81 2,52 % encontrado% teórico 11,72 12,21 12,34 7,92 8,01 7,96 14,34 14,3 14,4 11,47 2,81 24,49 % calificación promedio por nivel Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple 12,09 7,97 14,35 64 A continuación se presenta el análisis gráfico de los datos de la exactitud. Figura N° 8: Gráfica cantidad de estándar encontrado versus cantidad agregada. Tabla N°16: El análisis estadístico del gráfico cantidad encontrada versus cantidad agregada. Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación r 0,9994 2 Coeficiente de determinación r 0.9988 Error típico Sx/y 0,2735 N° Determinaciones 3 Intercepción eje Y -0,1836 Pendiente 1,15170 Criterios de aceptación 0.995 0.95 Calificación Cumple Cumple Con los resultados obtenidos, se establece que la metodología analítica para la identificación y valoración de calcitonina de salmón en solución para inhalación, cumple con los parámetros de aceptación para la exactitud en el rango comprendido entre el 65% y 150% de la concentración de trabajo. 65 5.1.5 Precisión Para el ensayo de repetibilidad, se preparó un estándar para cada nivel de concentración (tres niveles en total) correspondientes al 16, 100 y 180% de la concentración de trabajo. Tabla N°17: Resultados ensayo de repetibilidad para el nivel 1 Solución Nivel 1 N° inyección Área 1 254082 2 251219 3 248268 Promedio DE % CV Criterio de aceptación %CV < 3 Concentración 6,9 UI/mL % 121,11 120,31 119,49 120,31 0,81 0,67 Cumple Tabla N°18: Resultados ensayo de repetibilidad para el nivel 2 Solución Nivel 2 N° inyección Área 1 527173 2 527103 3 529987 Promedio DE % CV Criterio de aceptación %CV < 3 Concentración 13,80 UI/mL % 98,54 98,53 98,93 98,67 0,23 0,23 Cumple 66 Tabla N°19: Resultados ensayo de repetibilidad para el Nivel 3. Solución Nivel 3 N° inyección Área 1 903692 2 898163 3 891370 Promedio DE % CV Criterio de aceptación %CV < 3 Concentración 20,7 UI/mL % 100,60 100,09 99,46 100,05 0,57 0,57 Cumple Para el ensayo de precisión Intermedia, se preparó un estándar para cada nivel de concentración (tres niveles) correspondientes al 16, 100 y 180% de la concentración de trabajo. Tabla N°20: Resultados ensayo de precisión intermedia para el Nivel 1 Solución Nivel 1 N° inyección Área 1 260444 2 250868 3 252376 Promedio DE % CV Criterio de aceptación %CV < 3 Concentración 6,90 UI/mL % 122,88 120,22 120,64 121,24 1,43 1,18 Cumple 67 Tabla N°21: Resultados ensayo de precisión intermedia para el Nivel 2 Solución Nivel 2 N° inyección Área 1 464029 2 462171 3 467070 Promedio DE % CV Criterio de aceptación %CV < 3 Concentración 13,80 UI/mL % 99,73 99,44 100,20 99,79 0,38 0,38 Cumple Tabla N°22: Resultados ensayo de precisión intermedia para el Nivel 3 Solución Nivel 3 N° inyección Área 1 771612 2 773606 3 762072 Promedio DE % CV Criterio de aceptación %CV < 3 Concentración 20,7UI/mL % 101,95 102,16 100,93 101,68 0,66 0,65 Cumple A continuación se presentan los resultados obtenidos para la precisión intermedia aplicando el “test de comparación de medias”. 68 Tabla N°23: Resultados comparación de medias para el Nivel 1 Comparación Medias Nivel 1 Día 1 Día 2 Media 120,31 121,24 Varianza 0,65 2,05 N° Determinaciones 3 3 Comparación de varianzas (criterio de aceptación Fcritico >Fcalculado) F critico (tabla) 9,28 Varianzas Iguales Fcalculado 1,3282993 Varianza común 0,381 Grados de libertad 4 Varianzas Iguales = Estadístico t experimental 1,0595 Valor t’ student (2 colas) 2,7764 Calificación texp< t crítico Cumple Tabla N°24: Resultados comparación de medias para el Nivel 2 Comparación Medias Nivel 2 Día 1 Día 2 Media 98,67 99,79 Varianza 0,05 0,15 N° Determinaciones 3 3 Comparación de varianzas (criterio de aceptación Fcritico >Fcalculado) F critico (tabla) 9,28 Varianzas Iguales Fcalculado 2,78978097 Varianza común 0,0992 Grados de libertad 4 Varianzas Iguales = Estadístico t experimental 1,8572 Valor t’ student (2 colas) 2,7764 Calificación texp< t critico Cumple 69 Tabla N°25: Resultados comparación de medias para el Nivel 3 Comparación Medias Nivel 3 Día 1 Día 2 Media 100,05 101,68 Varianza 0,33 0,44 N° Determinaciones 3 3 Comparación de varianzas (criterio de aceptación Fcrítico >Fcalculado) F crítico (tabla) 9,28 Varianzas Iguales Fcalculado 1,3282993 Varianza común 0,381 Grados de libertad 4 Varianzas Iguales = Estadístico t experimental 2,4010 Valor t’ student (2 colas) 2,7764 Calificación texp< tcrítico Cumple Con los resultados obtenidos, se establece que la metodología analítica para la identificación y valoración de calcitonina de salmón en solución para inhalación, cumple con los parámetros de aceptación para la repetibilidad y precisión intermedia, en el rango comprendido entre el 16 y 180% de la concentración de trabajo. 70 5.1.6 Intervalo Los resultados obtenidos en los parámetros de linealidad, precisión y la exactitud está determinado por el parámetro que posea el rango de trabajo más estrecho, para el caso, esta dado por el nivel 52,3% y el nivel superior 121,0% que equivale a una concentración de 7,21 UI/mL a 16,76 UI/mL respectivamente, en donde el método analítico es lineal, preciso y exacto. 5.2 Reporte de validación Finalizada las pruebas de análisis para la implementación de la validación analítica, se procedió a confeccionar el reporte de validación de acuerdo a los requerimientos internos del laboratorio nacional de control del ISP bajo el nombre de reporte de validación de metodología analítica para la identidad y valoración de calcitonina de salmón en solución para inhalación por HPLC con código interno RV-422.000-123 este reporte es de carácter confidencial, por lo que se reserva el derecho de excluirlo. 71 6. DISCUSIÓN El Instituto de Salud Pública de Chile es la institución de referencia nacional encargada de la normalización y fiscalización de medicamentos así como de los organismos que lo fabrican. Debido a esto la validación de la metodología es de vital importancia para dar cumplimiento a los tiempos de análisis y entrega de resultados confiables. El proceso de validación de la metodología analítica estandarizada se desarrollo siguiendo los planteamientos del sistema de gestión de calidad perteneciente al Subdepartamento Nacional de Control del Instituto de Salud Pública el cual utiliza parámetros que han sido establecidos para cumplir con los marcos regulatorios nacionales e internacionales (USP 34, 2011; NCH ISO 17.025, 2001). La metodología analítica USP se modificó en cuanto al volumen de inyección. En la monografía de la USP está indicado un volumen de 200 L, pero producto de que el estándar de trabajo tenía L para mejorar de esta manera la respuesta. Se realizó un cambio en la gradiente de la fase móvil, mediante la modificación de los tiempos de cada fase (A y B), la USP indicaba que de los 0 minutos a los 30 minutos se debía presentar una proporción de un 72%A y un 28% de B, de los 30minutos a los 32 minutos, una proporción de un 48% de A y un 52% de B y de los 32 minutos a los 55 minutos se volvió a la proporción inicial de ambas fases, durando 55 minutos el tiempo de análisis. Estas proporciones fueron modificadas, para lograr una mejor resolución de la señal cromatográfica, una buena separación del analito en estudio y disminuir el tiempo de análisis, para ello del tiempo 0 al 0,01 minuto se tenía un 72% de fase A y un 28% fase B, a los 35 minutos la proporción 72 cambia a un 48% de fase A y un 52% de fase B, a los 35,01 minutos la proporción cambia nuevamente a los porcentajes de inicio finalizando hasta los 45 minutos, pues no se encontraron picos influyentes después de este tiempo. (USP 31, 2011). La evaluación de la estabilidad de las muestras evidenció que el análisis de las mismas debía llevarse a cabo el día en que éstas fueron preparadas. Durante el ensayo se apreció que el área de las inyecciones en los días siguientes aumentó, indicando que la muestra se fue concentrando, lo cual podría deberse a una evaporación de solvente utilizado para prepararlas (Protocolo de validación, 2007). Queda la posibilidad de realizar nuevamente este ensayo, controlando de mejor manera las condiciones de almacenamiento y contando con material que asegura una completa hermeticidad para el almacenamiento de las muestras. El método demostró ser específico para la señal de calcitonina debido a que no presenta señales que se superpongan con los del analito de interés en las diferentes condiciones que fue sometida la muestra. Además se aprecia que la resolución entre la señal de calcitonina y el resto de los analitos es mayor a 2, con lo que se asegura un solapamiento de los picos menor al 0,3 % (Pérez et al, 2001). Durante la evaluación de la linealidad se encontró que la metodología no cumple para el valor definido para el factor respuesta también se evidenció que el coeficiente de correlación no fue el esperado, se aplicó el test de Student para evaluar la significancia estadística de estos resultados. Demostrándose que el método es lineal y debe aplicarse bajo ciertas condiciones por lo que es necesario interpolar el resultado del análisis de cualquier muestra entre al menos dos estándares, uno superior y uno inferior a la concentración de trabajo, para anular de esta manera el sesgo que presenta el método. Se recomienda que la concentración del estándar inferior sea 73 aproximadamente un 70% de la concentración de trabajo, mientras que la del estándar superior sea de un 130%. Lo cual debe estar claramente detallado en el correspondiente instructivo (Pérez et al, 2001, Chan et al, 2004). Los resultados de los ensayos realizados para evaluar la precisión del método cumplieron con lo esperado en los criterios de aceptación definidos, los valores obtenidos en los tres niveles en los cuales se evaluó la repetibilidad fueron de 1,16%, 0,31% y 0,69 por lo tanto son menores al 3%. En relación precisión intermedia, los resultados demostraron que la metodología no se ve afectada cambiando algunas las condiciones de trabajo, cómo analista, equipo, día etc. (Procedimiento de validación, 2007; Miller et al, 2002). Para evaluar la exactitud del método se utilizó la técnica de recuperación de cantidades conocidas de analito añadidas sobre una muestra estándar, este estudio se evaluó en tres niveles de concentración (bajo, medio y alto) correspondientes al 65, 100 y 150% de la concentración de trabajo. Utilizó como criterio de aceptación los establecidos para un bioanálisis debido al origen biológico de la molécula activa (Pérez, 2001). El promedio de los tres niveles evaluados fueron 111,47% lo cual se encuentra dentro de los limites definidos (85%-115%), ese valor debe ser considerado al momento del análisis rutinario para normalizar los resultados obtenidos (Peréz et al, 2001; Chan et al 2004). El intervalo de trabajo esta dado por el nivel inferior de la exactitud que es de 52,2% y el nivel superior de la precisión 121,0% que equivale a una concentración de 7,21 UI/mL y 16,76 UI/mL respectivamente, incluyendo de esta manera las concentraciones teóricas esperadas para las muestras y donde el método analítico es lineal, preciso y exacto (Pérez et al, 2001; Chan et al, 2004). 74 7. CONCLUSIONES  Se logró implementar y validar la metodología analítica por HPLC para la cuantificación de calcitonina de salmón en un producto farmacéutico terminado, basándose en los criterios definidos por la USP. De esta manera se aportó en el trabajo que está desarrollando el Instituto de Salud Pública para contar con todas sus metodologías analíticas validadas, y fortalecer de esta manera su rol como ente referencial.  Se estableció la estandarización de la metodología analítica mediante la aplicación del test de idoneidad del sistema.  Se demostró, a través de los parámetros de desempeño analítico, que el método validado para la solución de inhalación de la calcitonina de salmón es lineal, reproducible, preciso y exacto. Además, cumple con los parámetros de selectividad para cada uno de los ensayos realizados.  Se documentaron los resultados obtenidos en los análisis y se elaboro un informe con los parámetros de desempeño de acuerdo a lo estipulado en el protocolo del departamento nacional de control.  El Laboratorio Nacional de Control debe elaborar un protocolo de validación para bioensayos debido a que el protocolo existente no cubre este tipo de análisis. 75 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS  B. Combe, C. Cohen, F. Aubin.,(1997). “Equivalence of Nasal Spray and Subcutaneous Formulations of Salmon Calcitonin”. 61, 10-15.  Flórez J., “Farmacología Humana” 3° Ed. Editorial Masson. 1997.940-941 p  Pérez Cuadrado J. 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Anexos Anexo N°1: Comparación de la secuencia aminoacídica entre la calcitonina porcina, bovina, de salmón y humana. 79 Anexo 2: Estabilidad día 2 Nº inyec 1 2 3 4 5 Tomando los 5 valores del día 1 y los 5 del día 2 Tr Asimetría Área FR 2,59 1,08 1501760,0 65293913,04 Área FR 2,59 1,02 1502440,0 65323478,26 Promedio 1308854 56906678 2,59 1,04 1498960,0 65172173,91 DE 203581 8851339 2,59 1,07 1501280,0 65273043,48 % CV 15,55 15,55 2,59 1,03 1499480,0 65194782,61 Promedio 1500784,0 65251478,26 Calificación CV DE 1497,36 65102,51 CV(5) Cumple % CV 0,10 0,10 CV(10) No Cumple Anexo3: Estabilidad día 3. Nº inyec 1 2 3 4 5 Tr 2,59 2,59 2,56 2,59 2,59 Asimetría 1,08 1,00 1,42 0,99 1,01 Promedio DE % CV Área 1454440,0 1490840,0 1482040,0 1484860,0 1480680,0 1478572,0 14043,39 0,95 FR 63236521,73913 64819130,43478 64436521,73913 64559130,43478 64377391,30435 64285739,13043 610582,05 0,95 Tomando los 5 valores del día 1 y los 5 del día 3 Área FR Promedio 1297747,6 56423808,69565 DE 192177,00 8355521,59 % CV 14,81 14,81 Calificación CV Cumple CV(10) No Cumple CV(5) 80 Anexo 4: Estabilidad día 4. Nº inyec 1 2 3 4 5 Tr 2,59 2,59 2,59 2,59 2,59 Asimetría 1,18 1,10 1,09 1,17 1,09 Promedio DE % CV Área 1501120,0 1498080,0 1508120,0 1509360,0 1505360,0 1504408,0 4745,05 0,32 FR 65266086,96 65133913,04 65570434,78 65624347,83 65450434,78 65409043,48 206306,62 0,32 Tomando los 5 valores del día 1 y los 5 del día 4 Área FR Promedio 1310665,6 56985460,86957 DE 205500,94 8934823,35 % CV 15,68 15,68 CV(5) CV(10) Calificación CV Cumple No Cumple Anexo 5: Estabilidad día 5. Nº inyec Tr Asimetría 1 21.640 1.116 2 2,59 1,30 3 2,59 1,27 4 2,59 1,25 5 2,59 1,17 Promedio DE % CV Área 1056804,0 1497240,0 1509640,0 1510100,0 1511120,0 1416980,8 201424,90 14,22 FR 45948000,00000 65097391,30435 65636521,73913 65656521,73913 65700869,56522 61607860,87 8757604,53 14,22 Tomando los 5 valores del día 1 y los 5 del día 5 Área FR Promedio 1266952,0 55084869,56522 DE 208699,37 9073885,79 % CV 16,47 16,47 Calificación CV CV(5) No Cumple CV(10) No Cumple