Tesis Electrónicas Uach - Universidad Austral De Chile

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Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia PROFESOR PATROCINANTE: Lorenzo Villa Z. FACULTAD: Farmacia UNIVERSIDAD: Concepción PROFESOR CO-PATROCINANTE: Karin Jürgens Sch. INSTITUTO: Farmacia FACULTAD: Ciencias “EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS ANSIOLÍTICO Y ANTIDEPRESIVO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE Modiola caroliniana EN RATONES” Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmaceútico RAMIRO ANDRÉS COFRÉ COFRÉ VALDIVIA – CHILE 2009 AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mis más sinceros agradecimientos: A mi profesor patrocinante Q.F Lorenzo Villa Zapata, por todo el apoyo brindado en la realización de este trabajo. Gracias por su profesionalismo y constante preocupación. A mi profesora co-patrocinante Q.F Karin Jürgens, por su profesionalismo y apoyo constante durante la realización del presente trabajo. A mi profesora informante Dra. Eliana Sánchez, por aceptar formar parte de la presente comisión. Al Sr. Joel Pardo, por la valiosa ayuda prestada durante la realización experimental del presente trabajo. A mis compañeros de la promoción 2002, especialmente a Samuel, Carlos, Pako, Rodrigo Aguilar, Sergio y Pato por todos los buenos momentos compartidos durante estos años. Finalmente, quiero agradecer a mi abuela Prosperina, a mi tía Bernardita y a mi mamá Elizabeth, por el apoyo incondiconal y constante que he recibido de ustedes durante toda mi vida; sin lugar a dudas son pilares fundamentales en la realización de este logro. ÍNDICE GENERAL 1. RESUMEN 1 1. ABSTRACT 3 2. INTRODUCCIÓN 5 2.1 Carga global de los trastornos mentales y conductuales…………………………...5 2.2 Ansiedad y Depresión: Generalidades………………………………………………..6 2.2.1 Ansiedad………………………………………………………………………………..6 2.2.2 Depresión………………………………………………………………………………7 2.2.3 Relación ansiedad / depresión……………………………………………………….7 2.2.4 Necesidad de desarrollo de nuevas alternativas de tratamiento………………...8 2.3 Modiola caroliniana……………………………………………………………………...9 2.3.1 Aspectos taxonómicos………………………………………………………………11 2.3.2 Nombres comunes…………………………………………………………………..11 2.3.3 Información botánica………………………………………………………………...11 2.3.4 Composición química………………………………………………………………..11 2.3.5 Hábitat…………………………………………………………………………………11 2.3.6 Usos en medicina tradicional……………………………………………………….12 2.3.7 Partes utilizadas de la planta……………………………………………………….12 2.4 Hipótesis………………………………………………………………………………..13 2.5 Objetivos………………………………………………………………………………..13 2.5.1 Objetivo General……………………………………………………………………. 13 2.5.2 Objetivos Específicos………………………………………………………………. 14 3. MATERIALES Y MÉTODOS 16 3.1 MATERIALES………………………………………………………………………….16 3.1.1 Material vegetal………………………………………………………………………16 3.1.2 Reactivos……………………………………………………………………………..16 3.1.2.1 Preparación del extracto………………………………………………………….16 3.1.2.2 Pruebas conductuales…………………………………………………………….16 3.1.2.3 Análisis fitoquímico………………………………………………………………..16 3.1.2.4 Material cromatográfico…………………………………………………………...18 3.1.2.5 Equipos……………………………………………………………………………..18 3.1.2.6 Instrumentos estudios conductuales…………………………………………….19 3.1.2.7 Material de laboratorio…………………………………………………………….19 3.2 MÉTODOS…………………………………………………………………………...…20 3.2.1 Planta………………………………………………………………………………….20 3.2.2 Preparación del extracto…………………………………………………………….20 3.2.3 Análisis fitoquímico…………………..………………………………………………20 3.2.4 Análisis cromatográfico…………………………..………………………………….22 3.2.5 Animales………………………….…………………………………………………..24 3.2.6 Determinación de la dosis de extracto a utilizar….………………………………24 3.2.7 Condiciones de experimentación………………………...……………………….. 25 3.2.8 Modelos experimentales de ansiedad y depresión………………………………26 3.2.8.1 Laberinto elevado en cruz……………………………………...…………………26 3.2.8.2 Prueba de campo abierto con agujeros…………………………………………29 3.2.8.3 Prueba nado forzado………………………………………………………………31 3.2.9 Análisis estadístico…………………………………………………………………..33 4. RESULTADOS 34 4.1 Análisis fitoquímico…………………………….………………………………………34 4.2 Análisis cromatográfico de los extractos…………………..………………………...37 4.3 Determinación de dosis del extracto a utilizar………..……………………………..47 4.4 Pruebas conductuales………………………………………………………………....49 4.4.1 Laberinto elevado en cruz…………………………………………………………..49 4.4.2 Prueba de campo abierto con agujeros…………………………………………...51 4.4.3 Prueba nado forzado………………….……………………………………………. 54 5. DISCUSIÓN 55 6. CONCLUSIONES 64 7. LITERATURA CITADA 65 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Modiola caroliniana………………………………………………………………..10 Figura 2. Prueba modificación de la conducta exploratoria………………………………25 Figura 3. Laberinto elevado en cruz..............................................................................28 Figura 4. Aparato de campo abierto con agujeros……………………………………….. 30 Figura 5. Nado forzado……………………………………………………………………….32 Figura 6. Reacciones de identificación.…………………………………………………….35 Figura 7. Reconocimiento de compuestos con núcleo esteroídeo. Reacción de Liebermann……………………………………………………………………………………..36 Figura 8. Cromatografía de los extractos metanólico (A y B) y clorofórmico (C y D) observados bajo luz UV a 254 y 365 nm. Eluyente acetato de etilo – metanol - agua (100:13,5:10)……………………………………………………………………………………38 Figura 9. Cromatografía de los extractos metanólico (A y B) y clorofórmico (C y D) observados bajo luz UV a 254 y 365 nm. Eluyente tolueno - acetato de etilo (93:7)…..40 Figura 10. Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico revelados con el reactivo de Liebermann-Burchard y observados al UV-Visible……………………………42 Figura 11. Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico revelados con el reactivo de Liebermann-Burchard y observados al UV-365 nm…………………………..43 Figura 12. Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico revelados con el reactivo de Kedde y observados al UV-Visible……………………………………………..45 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Investigación de constituyentes solubles en agua……………………………..21 Tabla 2. Investigación de constituyentes insolubles en agua……………………….......21 Tabla 3. Reacciones de indentificación de alcaloides……………………………………22 Tabla 4. Disolventes utilizados sobre los dos extractos en estudio para la identificación de compuestos químicos…………………………………………………….........................23 Tabla 5. Resultado de los ensayos fitoquímicos de los constituyentes solubles en agua……………………………………………………..……………….……………………..34 Tabla 6. Resultado de los ensayos fitoquímicos de los constituyentes insolubles en agua…………………………………………………………………………...........................36 Tabla 7. Resultado de los ensayos fitoquímicos realizados para determinar presencia de alcaloides……………………………………………………………………………………37 Tabla 8. Determinación de compuestos polares presentes en los extractos clorofórmico y metanólico de Modiola caroliniana…………………………………………………………39 Tabla 9. Determinación de compuestos lipofílicos presentes en los extractos clorofórmico y metanólico de Modiola caroliniana………………………………………….41 Tabla 10. Investigación de compuestos con núcleo esteroideo…………………….......44 Tabla 11. Determinación de heterósidos cardiotónicos (genina con 23 átomos de carbono)…………………………………………………………………………………………46 . ÍNDICE DE GRÁFICOS Gráfico 1. Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis sobre el número de empinamientos……………………………………………………………………………...47 Gráfico 2. Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis sobre el Nº de cruces del círculo central………………………………………………………………………48 Gráfico 3. Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre el porcentaje de tiempo de permanencia de los ratones en las ramas abiertas del Laberinto elevado en cruz……………………………………………………....49 Gráfico 4. Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre la actividad motora de ratones, en el Laberinto elevado en cruz……..50 Gráfico 5. Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre el Nº de exploraciones subterráneas en la prueba de campo abierto con agujeros……………………………………………………………………………………51 Gráfico 6. Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre el tiempo de exploración subterránea en la prueba de campo abierto con agujeros……………………………………………………………………………………52 Gráfico 7. Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre la actividad motora de ratones en la prueba de campo abierto con agujeros…………………………………………………………………………………………53 Gráfico 8. Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre el tiempo de inmovilidad, en la prueba de Natación forzada………….54 1 1. RESUMEN Modiola caroliniana (“pila-pila”) es una planta herbácea y rastrera de 15 a 45 cm de tamaño, perteneciente al orden de las malváceas. En Chile es posible encontrar esta especie desde Coquimbo hasta Chiloé. El extracto de esta planta, es utilizado en medicina tradicional mapuche para tratar depresiones, cuadros de ansiedad, fatiga por trabajo intelectual excesivo y agotamiento nervioso. Se evaluaron los efectos ansiolítico y antidepresivo atribuidos popularmente al extracto de Modiola caroliniana utilizando modelos de conducta animal. El efecto ansiolítico se evaluó usando las pruebas de laberinto elevado en cruz y campo abierto con agujeros y el efecto antidepresivo se evaluó con la prueba de nado forzado. Previo a la realización de las pruebas, ratones machos de la especie Mus musculus cepa Rockefeller fueron divididos en tres grupos experimentales (A, B y C) y posteriormente recibieron vía intraperitoneal 30 minutos antes de ser sometidos a los test: cloruro de sodio (control negativo, grupo A), extracto de M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg (grupo B) o una droga de referencia (control positivo, grupo C) según corresponda. El extracto metanólico de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg no modifica la actividad motora ni el porcentaje de permanencia de los ratones en las ramas abiertas del laberinto. Tampoco modifica la actividad motora, frecuencia y duración de las exploraciones subterráneas en la prueba de campo abierto con agujeros. En la prueba de natación forzada no presentó efecto anti-inmovilidad. El análisis fitoquímico y cromatográfico (capa fina) permitió determinar en la planta, la presencia de mucílagos, azúcares no reductores y a lo menos un compuesto con núcleo esteroídeo. 2 El extracto metanólico de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg administrado vía intraperitoneal carece de los efectos ansiolítico y antidepresivo que popularmente se le atribuyen en medicina tradicional mapuche. 3 1. ABSTRACT Modiola caroliniana is an herbaceous creeper plant 15 to 45 cm in size belonging to the malvaceas order. In Chile, it is possible to find this species from Coquimbo to Chiloé. The extract of this plant is used in traditional Mapuche medicine to treat depression, anxiety, and fatigue due to excessive intellectual effort. In the study, anxiolytic and anti-depressive effects, traditionally attributed to the extract of Modiola caroliniana, were assessed by employing animal behaviour models. The anxiolytic effect was assessed by the Elevated Plus-Maze Test and by and the HoleBoard Test, while the anti-depressive effect was assessed by the Forced Swimming Test. Before carrying out the tests, Mus musculus male mice from the Rockefeller strain were separated into three experimental groups (A, B and C). Thirty minutes before the mice were exposed to the tests, they received through intraperitoneal injection: sodium chloride (negative control, group A); M. Caroliniana extract in a dose of 150 mg/kg (group B) or a reference drug (positive control, group C) as applicable. The methanolic extract of the Modiola Caroliniana did not modify the physical activity nor the percentage of permanence of the mice in the open branches of the maze. The extract also did not modify the physical activity, frequency, or duration of the underground explorations in the Hole-Board Test. During the Forced Swimming Test the extract did not cause any anti-immobility effect. The presence of mucilages, non reducers sugars and at least one compound steoideo nucleus was identified using phytochemical analysis and thin later chromatography (TLC). 4 The methanolic extract of Modiola caroliniana in dose of 150 mg/kg delivered through intraperitoneal injection lacks the anxiolytic and anti-depressive effects that described by traditional Mapuche medicine. 5 2. INTRODUCCIÓN 2.1 Carga global de los trastornos mentales y conductuales Los trastornos mentales y del comportamiento afectan aproximadamente a 450 millones de personas en todo el mundo. Este tipo de trastornos se caracterizan por su frecuencia, más del 25% de la población los padece en algún momento de su vida. Son también universales, afectan a personas de todas las edades, países y sociedades. Traen consigo un impacto emocional y también económico que repercute directamente sobre la calidad de vida de los individuos, familias y sociedades que los padecen (OMS, 2001). Se calcula que el gasto ocasionado por estos trastornos puede equivaler a 3-4% del producto interno bruto de los países desarrollados (Minoletti y Zaccaria, 2005). El informe sobre Salud en el Mundo 2001 ha estimado que en 1990, el 10% de los Años de Vida Ajustados por Discapacidad (AVAD), eran consecuencia de los trastornos mentales y del comportamiento. Para el año 2000 ese porcentaje había aumentado al 12%, y se estima que llegará hasta el 15% en 2020, siendo los trastornos frecuentes las depresiones, cuadros de más ansiedad, uso de sustancias psicoactivas, esquizofrenia, epilepsia y enfermedad de Alzheimer (OMS, 2001; Cañoles, 2007). En Chile, los trastornos de la salud mental y del comportamiento constituyen un problema de salud pública de primera importancia, como lo demuestran los datos sobre prevalencia de trastornos mentales graves en atención primaria que sitúan a Santiago de Chile en el primer lugar en incidencia de depresión (29,5%), en el segundo lugar (18,7%) en incidencia de ansiedad y en el sexto lugar en dependencia de alcohol (2,5%) entre distintas ciudades del mundo (OMS, 2001). 6 2.2 Ansiedad y Depresión: Generalidades El estado de ánimo y las emociones son dos facetas de la conducta. Según Nestler et al. (2001), las emociones son respuestas adaptativas transitorias a estímulos externos, internos y cognoscitivos. Por su parte, el estado de ánimo se refiere a una conducta persistente en el individuo, por ejemplo, de ansiedad, depresión o euforia (Vera, 2005). 2.2.1 Ansiedad La ansiedad puede ser una emoción normal y un trastorno psiquiátrico, dependiendo de su intensidad y de su repercusión sobre la actividad de la persona. En condiciones normales constituye uno de los impulsos vitales que motiva al individuo a realizar sus funciones y a enfrentarse a situaciones nuevas. La ansiedad se convierte en patológica cuando adquiere tal protagonismo que el individuo desplaza hacia ella toda su atención, interfiriendo de forma negativa en su rendimiento y funcionamiento psicosocial. Las manifestaciones de ansiedad consisten en una respuesta vivencial, fisiológica, conductual y cognitiva, caracterizada por un estado generalizado de alerta y activación. En términos patológicos la ansiedad puede describirse como la vivencia de un sentimiento de amenaza, de expectación tensa hacia el futuro y de alteración del equilibrio psicosomático en ausencia de un peligro real o, por lo menos, desproporcionada en relación con el estímulo desencadenante (Gastó y Vallejo, 2000; Flórez, 2003). 7 2.2.2 Depresión La sociedad Americana de Psiquiatría define la depresión como un trastorno heterogéneo que se manifiesta con síntomas a nivel psicológico, conductual y fisiológico que provocan en el paciente una pérdida de interés y placer por realizar casi todas las actividades que le son cotidianas, para su diagnóstico estos síntomas deben persistir a lo menos por dos semanas (Cryan et al, 2002; Borsini y McArthur, 2006). El Ministerio de Salud (Minsal, 2006) define la depresión como una alteración patológica del estado de ánimo con descenso del humor que termina en tristeza, acompañada de diversos síntomas y signos de tipo vegetativo, emocionales, comportamiento y de los ritmos vitales que persisten por un del pensamiento, del tiempo habitualmente prolongado (a lo menos de dos semanas). Wei et al. (2008), define la depresión como un cuadro clínico complejo, caracterizado por una serie de manifestaciones ideativas, de la conducta y afectivas, que provocan en el paciente angustia, tristeza, inhibición psicomotora y de la función cognitiva, como síntomas predominantes. 2.2.3 Relación ansiedad / depresión Por muchos años la depresión y la ansiedad fueron consideradas enfermedades mentales diferentes, siendo las benzodiazepinas las drogas de elección utilizadas para tratar los estados agudos de ansiedad y los inhibidores de la recaptación de monoaminas e inhibidores de la monoamino oxidasa las drogas de elección para tratar la depresión (Mora et al, 2005a). Sin embargo en la actualidad, los datos clínicos sobre patrones sindrómicos, curso evolutivo y respuesta terapéutica, muestran una asociación cada vez mayor entre ansiedad y depresión, en muchos casos con solapamiento entre ambos cuadros, lo que hace que hoy en día los márgenes entre ambos síndromes sean 8 cada vez más imprecisos (Elliott et al, 1992; Gastó y Vallejo, 2000). En el tratamiento de los trastornos de ansiedad, las benzodiazepinas están siendo lentamente sustituidas por los antidepresivos, los cuales no sólo son eficaces en la depresión sino también en el tratamiento de los cuadros agudos y crónicos de los trastornos ansiosos (Buller y Legrand, 2001). La indicación clínica para muchos de los nuevos compuestos antidepresivos incluye tanto los trastornos depresivos como los cuadros de ansiedad. 2.2.4 Necesidad de desarrollo de nuevas alternativas de tratamiento A la fecha se han desarrollado un gran número medicamentos para tratar los cuadros depresivos y los trastornos de ansiedad (Mora et al, 2006). Pese a ello, el actual arsenal farmacológico sigue siendo insuficiente, ya que un tercio de los pacientes que sufren este tipo de trastornos son intolerantes o refractarios a los tratamientos actualmente disponibles (Bhattamisra et al, 2008). Este escenario, exige el desarrollo de nuevas drogas que permitan ofrecer tratamientos más eficaces y mejor tolerados a los pacientes que sufren este tipo de patologías. El desarrollo de terapias en base a plantas medicinales podría ser considerado una alternativa o complemento a los tratamientos actualmente disponibles. La investigación de plantas medicinales para el tratamiento de enfermedades psiquiátricas ha avanzado considerablemente en el último decenio. Así lo refleja el creciente número plantas medicinales cuyo potencial psicoterapéutico ha sido evaluado en una gran variedad de modelos animales de conducta. Estos estudios han proporcionado valiosa información para el desarrollo de nuevas terapias farmacológicas basadas en plantas medicinales para su uso en psiquiatría clínica. Productos naturales como el Hipericum perforatum, Panax ginseng, Piper methysticum y Ginkgo biloba fueron introducidos en la práctica psiquiátrica durante la década pasada (Zhang, 2004). 9 2.3 Modiola caroliniana El hombre desde el principio de los tiempos, ha utilizado las plantas para vestirse, alimentarse, construir sus viviendas y recuperar su salud. Según relata la historia, los vegetales fueron los primeros medicamentos utilizados por el hombre para satisfacer sus necesidades de salud, aliviando síntomas, previniendo o curando enfermedades. Por este motivo, no es de extrañar que muchas de las medicinas de hoy tengan su origen directo o indirecto en las investigaciones de plantas a las cuales popularmente se le atribuyen propiedades medicinales (Lewis, 1997). Según la OMS, las plantas medicinales son todos aquellos vegetales que poseen en uno o más de sus órganos sustancias que puedan ser utilizadas con finalidad terapéutica o que son precursoras para la semisíntesis químico-farmacéutica (Montes et al, 1992). En la actualidad, se estima que sólo el 5-10% del total de plantas presentes en nuestro planeta han sido investigadas respecto a su composición química o actividad biológica (Montes et al, 1992), constituyendo un recurso excepcionalmente vasto de productos biológicamente activos, que pueden ser útiles por si mismos o bien pueden servir como fuente natural de nuevos prototipos químicos para el desarrollo de derivados modificados con actividades farmacológicas incrementadas y/o toxicidad reducida. Ante la imposibilidad de estudiar las sustancias biológicamente activas de las más de 500.000 especies de plantas que se encuentran en la tierra y el mar, la medicina tradicional se presenta como un punto de partida razonable en la búsqueda de principios activos con potencial terapéutico (Medina et al, 1997). 10 Modiola caroliniana (Fig. 1) es una planta herbácea y rastrera de 15 a 45 cm de tamaño, perteneciente al orden de las Malváceas. En Chile esta especie es conocida popularmente como “pila-pila” y es utilizada en medicina tradicional mapuche para tratar ciertos trastornos mentales y conductuales (Houghton y Manby, 1985; Farmacia Makelawen, comunicación verbal). No se ha encontrado información en la literatura publicada en la que se hayan evaluado científicamente los efectos farmacológicos popularmente descritos. Figura 1: Modiola caroliniana 11 2.3.1 Aspectos taxonómicos Taxonómicamente Modiola caroliniana es una planta perteneciente al Reino Plantae; Sub-reino Traqueobionta; Superdivisión Spermatophyta; División Magnoliophyta; Clase Magnoliopsida; Sub-clase Dillenidae; Orden Malváceas (Heike et al, 2005). 2.3.2 Nombres comunes Entre los nombres comunes de esta especie destaca pila-pila, sana todo, escobillo, hiedra y babosilla (Montes et al, 1992; Del Vitto et al, 1996; Heike et al, 2005). 2.3.3 Información botánica Modiola caroliniana es una planta herbácea y rastrera de 15 a 45 centímetros de tamaño, tiene un tallo ascendente con raíces que presentan nudos, posee hojas alternas de 1,5 a 4 centímetros de longitud y en periodo de inflorescencia produce flores axilares, pequeñas y solitarias (Rzedowski et al, 2001). 2.3.4 Composición química Sólo se ha descrito la presencia de mucílagos en la planta (Montes et al, 1992). 2.3.5 Hábitat Esta planta crece en suelos bajos, húmedos y fértiles. Es común encontrarla a orillas de los caminos y en medio de siembras. En Chile es posible encontrarla desde Coquimbo hasta Chiloé (Montes et al, 1992; Farmacia Makelawen, comunicación personal). 12 2.3.6 Usos en medicina tradicional Montes et al. (1992) describe que esta planta es utilizada en forma externa sobre la piel, por sus propiedades emolientes y de forma interna se utiliza para tratar dolores de garganta. En Argentina, se utiliza tradicionalmente por sus propiedades refrescantes, calmantes y emolientes (Del Vitto et al, 1996). En México, la infusión de las hojas se utiliza como calmante y refrescante (Heike et al, 2005). Los mapuches utilizan el jugo de las hojas para tratar cuadros infecciosos y enfermedades cardiovasculares y atribuyen al jugo de la planta propiedades refrescantes, vigorizantes y antidepresivas (Houghton y Manby, 1985). En Chile, la farmacia mapuche Makelawen comercializa a través de su red de locales ubicados en distintas ciudades de país, y también por Internet, el extracto de esta planta para tratar depresiones, neurosis con humor cambiante, fatiga por trabajo intelectual excesivo y agotamiento nervioso. 2.3.7 Partes utilizadas de la planta La medicina tradicional mapuche utiliza tanto las partes aéreas de la planta como las raíces, recolectadas preferentemente en primavera durante el periodo de inflorescencia (Farmacia Makelawen, comunicación personal). 13 Considerando la prevalencia y comorbilidad de las enfermedades mentales a nivel mundial, sumado ésto a la necesidad de desarrollar nuevas terapias más eficaces y con una menor incidencia de efectos segundarios, se propone en la presente tesis la realización de un estudio psicofarmacológico con el fin de evaluar el potencial ansiolítico y antidepresivo atribuido en medicina tradicional mapuche al extracto de Modiola caroliniana. 2.4 Hipótesis de trabajo • Modiola caroliniana (pila-pila) presenta propiedades ansiolíticas, que modifican conducta en ratones. • Modiola caroliniana (pila-pila) presenta propiedades antidepresivas, que modifican conducta en ratones. 2.5 Objetivos 2.5.1 Objetivo General Evaluar los posibles efectos antidepresivos y ansiolíticos del extracto metanólico de Modiola caroliniana en ratones. 14 2.5.2 Objetivos Específicos • Recolectar material vegetal en periodo de inflorescencia, correspondiente a hojas, ramas y raíces de Modiola caroliniana. • Obtener un extracto metanólico de las hojas, ramas y raíces secas y molidas de Modiola caroliniana. • Realizar una cualitativamente caracterización fitoquímica de la especie y evaluar mediante cromatografía en capa fina (c.c.f) el extracto metánolico y clorofórmico de Modiola caroliniana. • Determinar una dosis de extracto metanólico a utilizar para su posterior administración a los animales de experimentación. • Evaluar y relacionar la acción ansiolítica y actividad motora de un extracto metanólico de Modiola caroliniana administrado intraperitonealmente en ratones, por medio del laberinto elevado en cruz. • Evaluar y relacionar la acción ansiolítica y actividad motora de un extracto metanólico de Modiola caroliniana administrado intraperitonealmente en ratones, por medio de la prueba de campo abierto con agujeros. 15 • Evaluar el efecto antidepresivo de un extracto metanólico de Modiola caroliniana inyectado intraperitonealmente en ratones, midiendo los tiempo de inmovilidad en la prueba del nado forzado. • Relacionar los efectos farmacológicos evaluados con el uso empírico y tradicional de Modiola caroliniana. 16 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 MATERIALES 3.1.1 Material vegetal Hojas, ramas y raíces secas y molidas de Modiola caroliniana. 3.1.2 Reactivos 3.1.2.1 Preparación del extracto: • Metanol (Merck) • Agua destilada 3.1.2.2 Pruebas conductuales Como fármaco ansiolítico de referencia: Diazepam (Laboratorio Mintlab). • Nombre IUPAC: 7-Cloro-1,3-dihidro-1-metil-5-fenil-2-H-1,4-benzodiazepin-2-ona. Como fármaco antidepresivo de referencia: Imipramina (Laboratorio Chile). • Nombre IUPAC: 3-(5,6-dihidrobenzo[b][1]benzazepina-11-il)-N,N-dimetilpropano-1- amina. • Controles: Suero Fisiológico del Laboratorio Braun. Solución de NaCl 0,9%. 3.1.2.3 Análisis fitoquímico • Acetato de plomo • Sulfato de sodio: Na2SO4 (Merck) • Antrona en medio sulfúrico • Reactivo de Molisch 17 • Ácido sulfúrico: H2SO4 (Merck) • Licor de Fehling • Etanol: CH3CH2OH (Merck) • S.R Tricloruro de fierro • Metanol: CH3OH (Merck) • Ácido clorhídrico: HCl (Merck) • Magnesio metálico • Cloroformo: CHCl3 (Merck) • Sulfato de sodio anhidro • Anhídrido acético • Etanol de 70º • S.R acetato básico de plomo • Ácido acético con trazas de FeCl3 • Ácido sulfúrico con trazas de FeCl3 • Solución al 2% de ácido 3,5-dinitrobenzoico en alcohol • NaOH 2N • Ácido pícrico al 1% en etanol • NaOH al 10% en agua • Amoniaco • Ácido nítrico: HNO3 • S.R Dragendorff • S.R Silicotúngstico 18 • S.R Bouchardat 3.1.2.4 Material cromatográfico Placas cromatográficas de sílica gel tipo 60 con indicador de fluorescencia (Alugram ®). Cámara cromatográfica de vidrio, dimensiones: 22 cm de alto; 11,5 cm de ancho; 23,5 cm de largo. Eluyentes: • Acetato de etilo : metanol : agua (100 : 13,5 : 10) • Tolueno : Acetato de etilo (93 : 7) Reactivos de coloración: • Reactivo de Kedde: 5 mL de ácido 3,5-dinitrobenzoico al 3% en etanol. 5 mL de NaOH 2M • Reactivo de Liebermann-Burchard: 5 mL anhídrido acético 5 mL de H2SO4 concentrado 50 mL de etanol absoluto 3.1.2.5 Equipos • Rotavapor (Büchi) • Balanza electrónica (Sensotronic) • Balanza analítica (Shimadzu) • Baño termorregulado (SW22) • Baño de ultrasonido (Ney Ultrasonik 208 H) 19 • Estufa de secado (Binder) • Lámpara de luz UV a longitud de onda de 254 y 366 nm • Agitador Vortex (Velp Scientífica) 3.1.2.6 Instrumentos estudios conductuales • Caja de acrílico • Cilindro de acrílico • Laberinto en cruz elevado • Aparato de campo abierto con agujeros 3.1.2.7 Material de laboratorio • Matraces aforados y Erlenmeyer de diferente graduación • Pipetas • Pizeta • Embudo de vidrio • Tubos de ensayo • Probetas de vidrio de diferente graduación • Espátula • Frascos de diferentes volúmenes • Papel filtro, Advantec MFS, Inc. Diámetro 11 cm, Nº2 • Crisoles de porcelana • Mortero de vidrio • Jeringas de tuberculina de 1 mL. 20 3.2 MÉTODO 3.2.1 Planta La planta en estudio, Modiola caroliniana, fue recolectada durante el mes de Diciembre de 2007 en los faldeos cordilleranos de la comuna de Curarrehue, provincia de Cautín, región de la Araucanía (39º 22´ latitud Sur – 71º 35´ longitud Oeste). 3.2.2 Preparación del extracto Se pesó 1,5 kg de hojas, ramas y raíces, secas y molidas y se dejó macerar por 48 horas en 5 litros de metanol, se filtró por gasa y posteriormente en papel filtro Advantec Nº2. Este procedimiento se realizó tres veces para agotar la extracción. El extracto metanólico obtenido, se concentró en un rotavapor hasta la obtención de una solución pastosa. Con la finalidad de extraer los restos de agua de la solución, ésta fue colocada en una estufa de secado a 75ºC por 24 horas, hasta la obtención de 121,90 gramos de extracto seco (8,13 % de rendimiento). 3.2.3 Análisis Fitoquímico El análisis fitoquímico tiene como objetivo analizar una droga vegetal utilizando técnicas simples y rápidas que permitan detectar la presencia de determinados grupos de compuestos o constituyentes específicos, aportando información al conocimiento de las drogas vegetales (Jürgens, 2007). 21 Tabla 1: Investigación de constituyentes solubles en agua Ensayos Metabolitos Reacción positiva Antrona en medio sulfúrico Todo tipo de azúcares Anillo color verde en la interfase Reactivo de Molish Azúcares reductores y no Anillo color violeta en la reductores interfase Licor de Fehling Azúcares reductores Precipitado rojizo Prueba de etanol Gomas y mucílagos Precipitado blanco gelatinoso Prueba de Espuma Saponinas Espuma abundante y persistente S.R. FeCl3 Reacción de la cianidina Taninos pirogálicos Coloración azul negro Taninos catéquicos Coloración verde Flavonas Coloración anaranjada Flavonoles Coloración rojo cereza Flavanonas Coloración rojo violáceo Tabla 2: Investigación de constituyentes insolubles en agua Ensayos Metabolitos Reacción positiva Reacción de Liebermann Núcleo Esteroideo Coloración verde Reacción de Heterósidos cardiotónicos Anillo color rojo pardo en Keller-Kiliani (con 2-desoxiazúcares) la interfase Reacción de Kedde Heterósidos cardiotónicos Color rojo violeta (genina de 23 átomos de C) Reacción de Baljet Heterósidos cardiotónicos Coloración anaranjada (genina de 23 átomos de C) Reacción de Bornträger Heterósidos antraquinónicos Coloración roja o rosada en fase acuosa 22 Tabla 3: Reacciones de identificación de alcaloides Ensayos Metabolitos Reacción positiva S.R Dragendorff Alcaloides Precipitado pardoanaranjado S.R Bouchardat Alcaloides Precipitado pardoanaranjado S.R Lugol Alcaloides Precipitado pardoanaranjado S.R Silicotúngstico Alcaloides Precipitado blanco 3.2.4 Análisis cromatográfico de los extractos El análisis cualitativo de los extractos metanólico y clorofórmico se realizó por medio de la técnica de cromatografía en capa fina (c.c.f). Se utilizaron como adsorbente cromatoláminas de gel sílice tipo 60 con indicador de fluorescencia (fase estacionaria). Las fases móviles utilizadas fueron mezclas de disolventes orgánicos con polaridades definidas, que actuaban como eluyentes sobre las cromatoláminas, permitiendo la partición diferencial de las moléculas entre el adsorbente y el disolvente procediéndose así a la separación. Las cromatoláminas fueron observadas tanto al UV-Visible como bajo una lámpara de luz UV a 254 y 365 nm y reveladas posteriormente con el reactivo de Kedde y Liebermann-Burchard con la finalidad de poner de manifiesto la presencia de determinados grupos de compuestos químicos en la planta. Ambos reactivos fueron preparados en el momento de su utilización y luego se aplicaron en forma de spray sobre los cromatogramas. Una vez aplicado el reactivo de 23 Liebermann-Burchard sobre los cromatogramas, estos fueron calentados a 100ºC por 5 minutos y posteriormente observados al UV-Visible y UV-365 nm con la finalidad de determinar la presencia de compuestos con núcleo esteroideo. Luego de la aplicación del reactivo de Kedde sobre los cromatogramas, estos fueron observados al UV-Visible (temperatura ambiente) con la finalidad de determinar la presencia de cardenólidos. En la siguiente tabla, se describen las fases móviles utilizadas sobre los dos extractos en estudio, para la identificación de los principales metabolitos secundarios (Hildebert y Sabine, 1996). Tabla 4: Disolventes utilizados sobre los dos extractos en estudio para la identificación de compuestos químicos Metabolitos Secundarios Flavonoides, amargos, saponinas, glicósidos Mezcla de disolventes principios Acetato de etilo : metanol : agua cardiacos, (100 : 13,5 : 10) alcaloides, antraglicósidos y arbutina Aceites esenciales, cumarinas, naftoquinonas, terpenos, Tolueno ácidos (93 : 7) lipofílicos en plantas y valpotriatos : Acetato de etilo 24 3.2.5 Animales En el estudio se emplearon ratones machos de la especie Mus musculus, cepa Rockefeller, de dos meses y medio de edad con pesos entre 30 y 45 gramos, provenientes del bioterio del Instituto de Inmunología de la Universidad Austral de Chile. Los animales permanecieron en grupos de 8 por jaula y fueron trasladados 24 horas antes de cada sesión experimental al bioterio del Instituto de Histología, adyacente al lugar de experimentación, y permanecieron allí bajo un fotoperiodo de luz-oscuridad de 12 horas (encendido de la luz a las 9ºº a.m), temperatura de 21 ºC con agua y alimento a libre disposición. Todos los experimentos fueron realizados en el Laboratorio de Farmacognosia y Toxicología del Instituto de Farmacia de la Universidad Austral de Chile, hasta donde se trasladaron los animales inmediatamente antes de realizar cada experimento. Todos los experimentos fueron realizados entre las 12 y 17 horas; periodo del día en el cual la actividad diurna de los animales es la máxima (Paeile y Saavedra, 1990). 3.2.6 Determinación de la dosis de extracto a utilizar La dosis de extracto a administrar, se determinó mediante una curva de dosis respuesta frente a la modificación de la conducta exploratoria de los animales al ser colocados en una caja de acrílico de 20 cm de ancho, 30 cm de largo y 7 cm de alto (Fig. 2). En el piso se dibujó un círculo concéntrico de 10 cm de diámetro, la observación comenzó con la colocación del animal en el círculo central y a partir de ese momento se midieron los siguientes parámetros: número de empinamientos y número de veces que el animal atraviesa el círculo central (conducta diagonal). 25 Figura 2: Prueba modificación de la conducta exploratoria Se utilizó un cronómetro manual y el tiempo de observación fue de 6 minutos (Buznego et al, 1998). La prueba fue video- grabada para su posterior análisis. La determinación se realizó con un total de 24 ratones, separados en 8 grupos de 3 ratones cada uno. A estos se les administraron las siguientes dosis de extracto: 12,5; 25; 50; 100; 150; 200 y 300 mg/kg de extracto. Las comparaciones fueron hechas frente a un grupo que recibió solución salina 12,5 ml/kg (Buznego et al, 1998; Reyes, 2000). 3.2.7 Condiciones de experimentación Las pruebas conductuales se realizaron en sesiones diferentes y en cada una de ellas se trabajó de manera simultánea con un grupo al cual se le administró solución salina (control negativo), un grupo inyectado con el extracto de Modiola caroliniana (resuspendido en solución salina) y otro grupo inyectado con una droga de referencia (control positivo). En las pruebas de nado forzado y laberinto en cruz elevado, se utilizaron 10 ratones por grupo y en la prueba de campo abierto con agujeros, se utilizaron 8 ratones por grupo, asignados en forma aleatoria a cada grupo experimental. 26 La unidad experimental y observacional en todos los experimentos correspondió al animal íntegro y cada uno fue testeado sólo una vez. 3.2.8 Modelos Experimentales de Ansiedad y Depresión Modelar un fenómeno biológico significa reducirlo a sus características más relevantes, con una consistencia estadística adecuada de manera que sea fácilmente abordable con la metodología de investigación disponible (Yannielli, 1999). A pesar de sus limitaciones obvias, como la imposibilidad de reproducir los síntomas subjetivos comunicados por los pacientes en la práctica clínica, los modelos animales en psiquiatría han contribuido significativamente al conocimiento de los mecanismos neuroquímicos y sustratos neuronales implicados en las enfermedades mentales y conductuales, por esta razón constituyen una interfase de utilidad con las neurociencias (Alguacil et al, 1996; Yannielli, 1999). Por una parte, son el canal más importante para que los desarrollos terapéuticos farmacológicos se incorporen dentro de la perspectiva clínica y por otra, estos modelos animales aportan información sobre el fundamento psicobiológico de las patologías psiquiátricas (Rosenwasser y Wirz-Justice, 1997). Un ejemplo de lo anterior lo proveen los estudios experimentales sobre ansiedad y depresión que permiten inferir si los componentes de un extracto vegetal tienen propiedades ansiolíticas y/o antidepresivas. 3.2.8.1 Laberinto elevado en cruz El laberinto elevado en cruz es una de las pruebas más utilizadas para evaluar ansiedad en ratones y es el modelo mejor validado desde el punto de vista conductual, farmacológico y fisiológico para este fin (Pellow et al, 1985). 27 El fundamento del test se basa en la preferencia de los roedores por los espacios cerrados del laberinto (ramas cerradas del laberinto) en relación a las abiertas. La interpretación más aceptada es que la exposición a un ambiente novedoso promueve tanto la exploración como el miedo, generando un conflicto de aproximación-evitación (Yanielli, 1999), de esta forma se asume que cuando el ratón está en las ramas abiertas experimenta sensaciones de vértigo, agorafobia y xenofobia que refuerzan el miedo y la evitación, en relación a las ramas cerradas (Lister, 1987; Dawson y Tricklebank, 1995). Se demostró así que el estado de ansiedad de un ratón es mayor en las ramas abiertas y que las drogas ansiolíticas como las benzodiazepinas, aumentan la exploración de las ramas abiertas y las ansiogénicas como las carbolinas la disminuían (Pellow y File, 1986). Adicionalmente, el laberinto nos permite obtener información de la actividad motora de los animales, medida por el número total de entradas a ambas ramas (Decker et al, 1994). El laberinto (Fig. 3) consiste en una cruz de acrílico formada por cuatro ramas perpendiculares (dos abiertas y dos cerradas) de iguales dimensiones (30 x 5 cm) unidas por una plataforma central opaca de 8 x 8 cm. Las ramas abiertas corresponden a superficies planas fabricadas en acrílico transparentes y las ramas cerradas corresponden a superficies opacas flanqueadas por paredes de 15 cm de altura. Tanto las ramas abiertas como las cerradas se encuentran opuestas y perfectamente alineadas entre sí. Todo este aparato se encuentra elevado a 40 cm de altura sobre una plataforma de madera (Maruyama et al, 1998). 28 Figura 3: Laberinto elevado en cruz El laberinto fue ubicado al interior de un biombo de paredes oscuras en el lugar de experimentación y la iluminación estuvo dada por tubos fluorescentes de 40 W que iluminaban con igual intensidad tanto las ramas abiertas como cerradas del laberinto. Previo a la realización de la prueba los animales fueron divididos en tres grupos de diez ratones cada uno (Grupos: A, B y C) y recibieron el siguiente tratamiento vía intraperitoneal 30 minutos antes de sometidos al test: a. Diazepam: Como fármaco ansiolítico de referencia, en dosis de 0,3 mg/kg (Grupo A) b. Extracto de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg (Grupo B) c. NaCl 0,9% como Control 12,5 ml/kg (Grupo C) La prueba comienza colocando individualmente cada ratón en la plataforma central del laberinto mirando hacia una de las ramas cerradas y desde ese momento se le deja explorar libremente durante 5 minutos. Los parámetros que se miden son el número de 29 veces que el animal ingresa a las ramas abiertas y cerradas del laberinto y el tiempo de permanencia en las ramas abiertas. Se considera que un animal ha entrado o salido de una rama, cuando apoyó las cuatro patas al interior o al exterior respectivamente. Una cámara de video en posición vertical sobre el laberinto permitió registrar la conducta de los animales mientras eran sometidos a la prueba. Después de completada la prueba, el laberinto fue limpiado con alcohol de 70º para remover los signos de territorialidad dejados por cada animal (Mora et al, 2005a). 3.2.8.2 Prueba de Campo Abierto con Agujeros Esta prueba desarrollada por Boissier y Simon (1962, 1964) y modificada por Takeda y colaboradores (1998), permite medir de manera simple y objetiva los cambios en el estado emocional de un ratón al ser expuesto a un ambiente novedoso (Tsuji et al, 2000). El fundamento del test se basa en la modificación del comportamiento exploratorio de los animales, evaluado en términos de cambios en la actividad motora (Nº de cruces) y en la frecuencia y duración de las exploraciones subterráneas (Kamei et al, 2001). Se demostró que las benzodiazepinas ansiogénicas como las carbolinas y las ansiolíticas como el diazepam, de manera selectiva, son capaces de disminuir y aumentar respectivamente la frecuencia y duración de las exploraciones subterráneas (Takeda et al, 1998). Bajo estas condiciones, una disminución en el estado de ansiedad de un ratón se refleja en un aumento de la frecuencia y duración de las exploraciones subterráneas, mientras que un estado ansiogénico disminuye dichos parámetros (Kamei et al, 2001). 30 Para la realización de la prueba se utiliza una caja de aluminio (35 cm x 35 cm x 15 cm) cuyas paredes son fabricadas de vidrio de 3 mm de espesor y el piso (que también es de aluminio) es de color gris oscuro (Mora et al, 2005b) (Fig. 4). El piso se encuentra dividido en 16 cuadrados de iguales dimensiones y en cada uno de ellos hay un agujero concéntrico de 2,5 cm de diámetro. Bajo la superficie del piso, un sistema de sensores de movimiento conectados a una computadora permiten medir y registrar de manera simple y objetiva la interrupción de los haces por un ratón explorando. El número de interrupciones y la duración de las mismas son analizados por medio de un software desarrollado por la empresa Cold Power Technologies especialmente para esta prueba. Figura 4: Aparto de Campo Abierto con Agujeros Previo a la realización de la prueba se forman tres grupos de diez ratones cada uno (Grupos: A, B y C) y reciben el siguiente tratamiento vía intraperitoneal 30 minutos antes de ser sometidos al test: 31 a. Diazepam: Como fármaco ansiolítico de referencia, en dosis de 0,3 mg/kg (Grupo A) b. Extracto de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg (Grupo B) c. NaCl 0,9% como Control 12,5 ml/kg (Grupo C) Al momento de llevar a cabo el experimento, cada animal es individualmente colocado en el centro de la plataforma con agujeros y se registra su actividad exploratoria durante 5 minutos. Los parámetros que medimos automáticamente son: • Nº de veces que introduce la cabeza en los agujeros • Tiempo total de exploración de los agujeros (segundos) y por observación directa (video-cámara): • Nº de veces que cruza los cuadrados Después de completada la prueba, el laberinto fue limpiado con alcohol de 70º para remover los signos de territorialidad dejados por cada animal (Mora et al, 2005a) 3.2.8.3 Prueba Nado Forzado Esta prueba desarrollada por Porsolt y colaboradores utilizando ratas y posteriormente validada por el mismo grupo empleando ratones, es el modelo más ampliamente utilizado en la actualidad para la evaluación preclínica de compuestos con potencial antidepresivo (Cryan, 2002). El uso generalizado de esta prueba se debe entre otros factores a su facilidad de implementación y a su capacidad para detectar un amplio espectro de sustancias de conocida acción antidepresiva en clínica (Borsini y Meli, 1988). La base teórica de este experimento se relaciona con el principio en el cual, el animal sometido a un estímulo estresante del que no puede escapar, experimenta al 32 inicio un periodo de intensa actividad y luego permanece suspendido inmóvil en el agua (Reyes, 2000). La inmovilidad generada en esta prueba se interpreta como una pérdida de motivación por escapar del estímulo estresante y se considera análoga a los comportamientos de desesperanza observados en los pacientes depresivos (Alguacil et al, 1996). Muchos de los antidepresivos clínicamente eficaces como amitriptilina, imipramina y desipramina son capaces de reducir los tiempos de inmovilidad. El instrumento utilizado para realizar el ensayo (Fig. 5), consiste en un cilindro de acrílico transparente de 25 cm de alto y 10 cm de diámetro, conteniendo agua a 25 ± 2 ºC hasta una altura de 10 cm desde el fondo (Wei et al, 2008; Reyes 2000). Figura 5: Nado Forzado Para realizar el ensayo se formaron tres grupos de diez ratones cada uno (Grupos: A, B y C) los cuales fueron sometidos al siguiente tratamiento vía intraperitoneal 30 minutos antes de ser sometidos a la prueba: 33 a. Imipramina: Como fármaco antidepresivo de referencia, en dosis de 12,5 mg/kg (Grupo A) b. Extracto de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg (Grupo B) c. NaCl 0,9% como Control 12,5 ml/kg (Grupo C) Una vez trascurrido este intervalo de tiempo, comienza a desarrollarse la prueba. Los ratones son colocados al interior del cilindro con agua y son forzados a nadar durante 6 minutos. Los parámetros que se registran son: el nado, definido como todos aquellos movimientos escapatorios, es decir, desplazamiento circular, trepado o buceo, y la inmovilidad definida como los movimientos mínimos que debe realizar el animal necesarios para mantener su cabeza fuera del agua y poder respirar (Borsini y Meli, 1998; Wei et al, 2008). Se realizó un pre-test de 2 minutos y durante los últimos 240 segundos se midieron los tiempos de inmovilidad (Porsolt et al, 1978). Con la finalidad de facilitar el registro de los tiempos de inmovilidad la sesión experimental fue grabada usando una video-cámara. 3.2.9 Análisis estadístico Las comparaciones para discriminar los tratamientos responsables de las diferencias significativas en todas las pruebas, fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tuckey). Se utilizaron los programas Excel® y SPSS® versión 15.0 para el procesamiento de los datos. El valor de la significancia estadística a partir de la diferencia del control es de *p<0,05. 34 4. RESULTADOS Los resultados se presentan divididos en dos partes, la primera corresponde a los análisis fitoquímicos y cromatográficos que tienen como objetivo demostrar la presencia de determinados grupos de compuestos químicos en la planta. La segunda parte corresponde a las pruebas conductuales, realizadas con el objeto de corroborar los efectos psicoactivos atribuidos al extracto de Modiola caroliniana. 4.1 Análisis fitoquímico Los resultados del análisis fitoquímico realizado a las hojas, ramas y raíces secas y molidas de Modiola caroliniana se encuentran resumidos en las siguientes tablas: Tabla 5: Resultados de los ensayos fitoquímicos de los constituyentes solubles en agua. Ensayos Metabolitos Resultado Antrona en medio Todo tipo de azúcares Positivo sulfúrico Reactivo de Molish Licor de Fehling (Fig. 6 A) Azúcares reductores y Positivo no reductores (Fig. 6 B) Azúcares reductores Negativo (Fig. 6 C) Prueba de etanol Gomas y mucílagos Positivo (Fig. 6 D) Prueba de Espuma Saponinas Negativo S.R. FeCl3 Taninos Negativo Flavonoides Negativo Reacción de la cianidina 35 Figura 6: Reacciones de Identificación A). Antrona en medio sulfúrico (Positiva) C). Licor de Fehling (Negativa) B). Reactivo de Molish (Positiva) D). Prueba de etanol (Positiva) 36 Tabla 6: Resultado de los ensayos fitoquímicos de los constituyentes insolubles en agua Ensayos Metabolitos Resultado Reacción de Liebermann Núcleo Esteroideo Positivo (Fig. 7) Reacción de Heterósidos cardiotónicos Keller-Kiliani (con 2-desoxiazúcares) Reacción de Kedde Heterósidos cardiotónicos Negativo Negativo (genina de 23 átomos de C) Reacción de Baljet Heterósidos cardiotónicos Negativo (genina de 23 átomos de C) Reacción de Bornträger Heterósidos antraquinónicos Negativo Figura 7: Reconocimiento de compuestos con núcleo esteroídeo. Reacción de Liebermann. 37 Tabla 7: Resultado de los ensayos fitoquímicos realizados para determinar presencia de alcaloides Ensayos Metabolitos Resultado S.R Dragendorff Alcaloides Negativo S.R Bouchardat Alcaloides Negativo S.R Lugol Alcaloides Negativo S.R Silicotúngstico Alcaloides Negativo 4.2 Análisis cromatográfico de los extractos La figura 8 muestra el resultado de los análisis cromatográficos realizados a los extractos metanólico y clorofórmico de Modiola caroliniana, utilizando como adsorbente cromatoláminas de gel sílice tipo 60 con indicador de fluorescencia y una mezcla de acetato de etilo-metanol-agua (100 : 13,5 : 10) como fase móvil. Frente de solvente 10 cm. 38 Figura 8: Cromatografía de los extractos metanólico (A y B) y clorofórmico (C y D) observados bajo luz UV a 254 y 365 nm. Eluyente acetato de etilo - metanol - agua (100:13,5:10) UV-254 nm A y B UV-365 nm C y D A y B C y D Se observa la aparición de una mancha con Rf 1,0 tanto en el extracto metanólico como clorofórmico de Modiola caroliniana que observada bajo luz UV a 254 y 365 nm revela un color verde oscuro y rojo fluorescente respectivamente. Estos resultados se encuentran resumidos en la tabla 8. 39 Tabla 8: Determinación de compuestos polares presentes en los extractos clorofórmico y metanólico de Modiola caroliniana. Extracto metanólico Detección Rf 1,0 Extracto clorofórmico Color observado Rf Color observado Verde oscuro 1,0 Verde oscuro UV-254 nm 1,0 Rojo fluorescente 1,0 Rojo fluorescente UV-365 nm La figura 9 muestra el resultado de los análisis cromatográficos realizado a los extractos metanólico y clorofórmico de Modiola caroliniana, utilizando como adsorbente las mismas cromatoláminas que en el caso anterior y una mezcla de tolueno-acetato de etilo (93:7) como fase móvil. Frente de solvente 10 cm. 40 Figura 9: Cromatografía de los extractos metanólico (A y B) y clorofórmico (C y D) observados bajo luz UV a 254 y 365 nm. Eluyente toluenoacetato de etilo (97:3) UV-365 nm UV- 254 nm A y B C y D A y B C y D En el cromatograma del extracto clorofórmico se observa la aparición de una mancha con Rf 0,47 que inspeccionada bajo luz ultravioleta a 254 y 365 nm revela un color amarillo y rojo fluorescente respectivamente. El cromatograma del extracto metanólico no revela la presencia de manchas. Estos resultados se encuentran resumidos en la tabla 9. 41 Tabla 9: Determinación de compuestos lipofílicos presentes en los extractos clorofórmico y metanólico de Modiola caroliniana. Extracto metanólico Detección Rf Color observado ---- -------- ----- ---------- Extracto clorofórmico Rf Color observado 0,47 Amarillo UV-254 nm 0,47 Rojo fluorescente UV-365 nm Después de realizada la inspección preliminar de los extractos metanólico y clorofórmico bajo luz ultravioleta a 254 y 365 nm, los cromatogramas fueron revelados con los reactivos de Kedde y Liebermann-Burchard con la finalidad de tener una orientación respecto a los tipos de compuestos presentes en la planta en estudio. La figura 10 muestra los cromatogramas de los extractos metanólico y clorofórmico revelados con el reactivo de Liebermann-Burchard y observados al UV-Visible. El cromatograma del extracto metanólico reveló la presencia de tres manchas de Rf 0,13 – 0,19 y 0,38 todas de color verde esmeralda. El cromatograma del extracto clorofórmico reveló igualmente la aparición de tres manchas a valores de Rf: 0,05 0,29 y 0,36 de colores verde esmeralda, amarilla y verde esmeralda respectivamente. 42 Figura 10: Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico revelados con el reactivo de Liebermann-Burchard y observados al UV-Visible. Extracto metanólico Extracto clorofórmico La figura 11 muestra los mismos cromatogramas que el caso anterior pero esta vez observados bajo luz UV- 365 nm. En el cromatograma del extracto metanólico se observa la aparición de una serie de manchas a valores de Rf 0,13 – 0,19 – 0,38 – 0,63 todas de color rojo fluorescente y 0,75 – 0,88 – 0,94 todas de color blanco. 43 En el cromatograma del extracto clorofórmico se observa la aparición de manchas a valores de Rf 0,05 – 0,18 – 0,29 – 0,36 de color rojo fluorescentes y 1,00 de color blanco. Figura 11: Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico revelados con el reactivo de Liebermann-Burchard y observados bajo luz UV a 365 nm. Extracto metanólico Extracto clorofórmico 44 Los resultados anteriormente mencionados se encuentran resumidos en la tabla 10. Tabla 10: Investigación de compuestos con núcleo esteroideo Fase estacionaria: Sílica gel Fase móvil: Tolueno-acetato de etilo (93:7) Revelador: Liebermann-Burchard Temperatura: 100 ºC Extracto metanólico Detección Rf Color observado Extracto clorofórmico Rf Color observado 0,13 Verde esmeralda 0,05 Verde esmeralda UV-Visible 0,19 Verde esmeralda 0,29 Mancha amarilla (Fig. 10) 0,38 Verde esmeralda 0,36 Verde esmeralda 0,13 Rojo fluorescente 0,05 Rojo fluorescente 0,19 Rojo fluorescente 0,18 Rojo fluorescente UV-365 nm 0,38 Rojo fluorescente 0,29 Rojo fluorescente (Fig. 11) 0,63 Rojo fluorescente 0,36 Rojo fluorescente 0,75 Blanco 0,88 Blanco 0,94 Blanco 1,00 Blanco 45 La figura 12 muestra los cromatogramas de los extractos metanólico y clorofórmico observados al UV-Visible después de haber sido revelados con el reactivo de Kedde. En el cromatograma del extracto metanólico se observa la aparición de manchas a valores de Rf 0,13 – 0,19 – 0,25 – 0,63 de colores café pálido, café, verde pálido, café y amarillo pálido respectivamente. En el cromatograma del extracto clorofórmico aparecen dos manchas a valores de Rf 0,31 y 0,36 de colores verde pálido y café pálido respectivamente. Figura 12: Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico revelados con el reactivo de Kedde y observados al UV-Visible Extracto metanólico Extracto clorofórmico 46 Los resultados anteriormente presentados se encuentran resumidos en la tabla 11. Tabla 11: Determinación de heterósidos cardiotónicos (genina con 23 átomos de carbono) Fase estacionaria: Sílica gel Fase móvil: Acetato de etilo-metanol-agua (100:13,5: 10) Temperatura: Ambiente Revelador: Kedde Extracto metanólico Detección Rf Color observado Extracto clorofórmico Rf Color observado 0,13 Café pálido 0,31 Verde pálido 0,19 Café 0,36 Café pálido UV-Visible 0,25 Verde pálido (Fig. 12) 0,63 Café 1,00 Amarillo pálido 47 4.3 Determinación de dosis del extracto a utilizar La prueba realizada para determinar la dosis de extracto a utilizar en el estudio, entregó los siguientes resultados: Gráfico 1: Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis sobre el Nº de empinamientos Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis sobre el Nº de empinamientos de los ratones (n=3) en la prueba de campo abierto. Los resultados están expresados como valor de la media y las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la significancia estadística a partir del control fue de *p <0.05 48 Gráfico 2: Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis sobre el Nº de cruces del círculo central Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis sobre el número de cruces del círculo central en la prueba de campo abierto. Los resultados están expresados como valor de la media y las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la significancia estadística a partir del control fue de *p <0.05. En los gráficos anteriores se observa que la dosis de extracto de Modiola caroliniana capaz de aumentar significativamente la conducta exploratoria de los ratones respecto al control, medida en términos de número de empinamientos y número de cruces del círculo central, fue de 150 mg/kg, utilizándose esta dosis para realizar el estudio. 49 4.4 Pruebas conductuales 4.4.1 Laberinto elevado en cruz El gráfico 3 muestra el porcentaje de tiempo de permanencia de los ratones en las ramas abiertas del laberinto en relación al tiempo total de exploración del aparato. Los resultados obtenidos para los tres grupos experimentales son los siguientes: Control 2,94%; Extracto 4,43% y Diazepam 18,83%. El grupo tratado con diazepam presenta diferencias estadísticamente significativas respecto del control (*p<0,05), no así el grupo tratado con el extracto. Gráfico 3: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre el porcentaje de tiempo de permanencia de los ratones en las ramas abiertas del Laberinto elevado en cruz. Efecto del extracto metanólico de Modiola caroliniana (150 mg/kg i.p) y Diazepam (0,3 mg/kg i.p) sobre el porcentaje de permanencia de los ratones (n=10) en las ramas abiertas en relación con el tiempo total de permanencia en el laberinto. Las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la significancia estadística a partir del control fue de *p<0,05. 50 El gráfico 4 muestra los resultados de la actividad motora de los ratones en el laberinto, expresados como el número total de entradas a ambas ramas ± el error estándar. Para el control se obtuvo 102 ±4,87; para el extracto 135 ±9,25 y para diazepam 244 ±5,44. Sólo presentó diferencias estadísticamente significativas respecto del control el grupo tratado con diazepam (*p<0,05), no así el grupo tratado con el extracto. Gráfico 4: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre la actividad motora de ratones, en el Laberinto elevado en cruz. Efecto del cloruro de sodio (12,5 ml/kg i.p), extracto metanólico de Modiola caroliniana (150 mg/kg i.p) y Diazepam (0,3 mg/kg i.p) sobre la actividad motora de ratones en el Laberinto elevado en cruz. Los resultados están expresados como el número total de entradas de los ratones (n=10) a ambas ramas del laberinto +/- el error estándar. Las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la significancia estadística a partir de control fue de *p< 0,05. 51 4.4.2 Prueba de campo abierto con agujeros El gráfico 5 muestra el efecto de los distintos tratamientos sobre el número de exploraciones subterráneas durante los 5 minutos de duración de la prueba de campo abierto con agujeros. El número de exploraciones para el control, tratado con NaCl 0,9% fue de 13,13± 6,47; para extracto fue 20,00 ± 8,88 y para el grupo tratado con diazepam fue 29,25 ± 3,45. El análisis de los resultados muestra que el grupo tratado con diazepam presenta diferencias estadísticamente significativas respecto al control (*p<0,05), no así el grupo tratado con el extracto. Gráfico 5: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre el Nº de exploraciones subterráneas en la prueba de campo abierto con agujeros. Efecto del cloruro de sodio (12,5 ml/kg i.p), extracto metanólico de Modiola caroliniana (150 mg/kg i.p) y diazepam (0,3 mg/kg i.p) sobre el número de exploraciones subterráneas en la prueba de campo abierto con agujeros. Los resultados están expresados como valor de la media ± el error estándar. Las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la significancia estadística a partir de control fue de *p< 0,05. 52 El gráfico 6 muestra el tiempo de duración de las exploraciones subterráneas, según tratamiento en la prueba. Los resultados obtenidos para el control son 8,56 ± 7,23 segundos ; para el extracto 12,56 ± 7,75 segundos y para el grupo tratado con diazepam 18,48 ± 3,49 segundos. Estos resultados muestran diferencias estadísticamente significativas (*p<0,05) respecto al control para el grupo tratado con diazepam, no así para el grupo tratado con el extracto. Gráfico 6: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre el tiempo de exploración subterránea en la prueba de campo abierto con agujeros. Efecto del cloruro de sodio (12,5 ml/kg i.p), extracto metanólico de Modiola caroliniana (150 mg/kg i.p) y diazepam (0,3 mg/kg i.p) sobre el tiempo de duración de las exploraciones subterráneas en la prueba de campo abierto con agujeros. Los resultados están expresados como valor de la media ± el error estándar. Las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la significancia estadística a partir de control fue de *p< 0,05. 53 El gráfico 7 muestra los resultados de la actividad motora de los ratones, medida en términos del número de cruces de los cuadrados dibujados en la superficie del piso, en la prueba de campo abierto con agujeros, según tratamiento. Para el grupo control se obtuvo 88,63 ± 28,04 cruces; para el extracto 81,75 ± 33,95 cruces y para diazepam 119,38 ± 46,19 cruces. El análisis de los datos no muestra diferencias estadísticamente significativas entre los distintos tratamientos, *p>0,05. Gráfico 7: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre la actividad motora de ratones en la prueba de campo abierto con agujeros. Efecto del cloruro de sodio (12,5 ml/kg i.p), extracto metanólico de Modiola caroliniana (150 mg/kg i.p) y diazepam (0,3 mg/kg i.p) sobre la actividad motora de ratones en la prueba de campo abierto con agujeros. Los resultados están expresados como valor de la media ± el error estándar. Las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA). No hay diferencias estadísticamente significativas entre los distintos tratamientos, p>0,05. 54 4.4.3 Prueba de nado forzado Los resultados de la prueba de natación forzada se muestran en el gráfico 8, expresados como valor de la media ± el error estándar de los tiempos de inmovilidad. Los valores obtenidos para el grupo control fueron 248,63 ± 10,99 segundos; para el grupo tratado con el extracto 264,16 ± 33,57 segundos y para el grupo tratado con imipramina 195,60 ± 48,59 segundos. Estos resultados muestran diferencias estadísticamente significativas respecto del control para el grupo tratado con diazepam (*p<0,05), no así para el grupo tratado con el extracto. Gráfico 8: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y diazepam sobre el tiempo de inmovilidad, en la prueba de Natación forzada. Efecto del cloruro de sodio (12,5 ml/kg i.p), extracto metanólico de Modiola caroliniana (150 mg/kg i.p) e imipramina (12,5 mg/kg i.p) sobre el tiempo de inmovilidad en la Prueba del Nado Forzado en ratones. Cada valor corresponde al promedio de 10 ratones por grupo ± el error estándar. Las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la significancia estadística a partir de la diferencia del control fue * p<0,05. 55 5. DISCUSIÓN En Chile, el uso de plantas medicinales con fines terapéuticos es una costumbre muy arraigada en la cultura popular, que persiste hasta nuestros días con diversos grados de influencia, especialmente indígena (Hoffmann, 2003). Los mapuches, principal pueblo originario de nuestro país, a través de la observación del medio que los rodeaba y mediante el error y el acierto, desarrollaron un gran conocimiento empírico respecto al uso de las plantas medicinales, que se fue transmitiendo de una generación a otra por vía oral y que hoy en día esta siendo gradualmente traspasado al resto de la población (Evans, 1991; Alonso, 1998; Errázuriz, 2006). En los últimos años, una visión más holística de la salud y la enfermedad ha incrementado la información y publicidad respecto al uso de plantas medicinales. Sin embargo, el fomento en la utilización de principios activos de origen vegetal, puede tornarse peligroso para el paciente, toda vez que se carezcan de estudios químicos, toxicológicos y farmacológicos que garanticen la seguridad y eficacia de una determinada especie a la que popularmente se le atribuyen ciertas propiedades medicinales. En el presente estudio, se evaluaron las propiedades ansiolíticas y antidepresivas atribuidas popularmente en medina tradicional mapuche al extracto de Modiola caroliniana. Adicionalmente, este estudio se complementó con una caracterización fitoquímica y cromatográfica (c.c.f) de la especie. En las pruebas de laberinto en cruz elevado y campo abierto con agujeros se evaluó el potencial ansiolítico del extracto, mientras que en la prueba de nado forzado se evaluó potencial antidepresivo. 56 El test de laberinto elevado en cruz considera como medida de ansiedad el porcentaje de permanencia de los ratones, en las ramas abiertas del laberinto. Una sustancia con propiedades ansiolíticas es capaz de aumentar el tiempo de exploración de dichas ramas situadas en alturas (Handley y McBlane, 1993; Rodgers et al, 1997). En este test, el grupo tratado con el extracto de M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg no produjo diferencias estadísticamente significativas respecto al control sobre el porcentaje de permanencia de los ratones en las ramas abiertas del laberinto, esto nos indica que M. caroliniana en esta dosis carece de los efectos ansiolíticos que popularmente se le atribuyen. En cambio, bajo las mismas condiciones experimentales, el grupo de referencia tratado con diazepam muestra diferencias estadísticamente significativas respecto al control en cuanto al porcentaje de permanencia en las ramas abiertas del laberinto, esto corrobora la propiedades ansiolítica del fármaco y coincide con otros trabajos que previamente han demostrado que la administración aguda de una dosis de diazepam, aumenta el tiempo de exploración y el porcentaje de permanencia en las ramas abiertas del laberinto (Ariza et al, 2006; Ariza et al, 2007). El extracto de M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg no modificó de manera significativa la actividad motora de los ratones en el laberinto respecto al control, medida por el número total de entradas a ambas ramas. Por el contrario, el grupo tratado con diazepam (0,3 mg/kg i.p.) aumentó de manera estadísticamente significativa respecto al control la actividad motora, lo cual coincide con lo demostrado por Kuribara et al. (1998) quien menciona que el diazepam en dosis menores a 5 mg/kg produce un aumento de la actividad motora, no así en la coordinación. 57 El efecto ansiolítico del extracto en estudio también fue evaluado en la prueba de campo abierto con agujeros. En esta prueba, un estado ansiolítico en ratones se refleja por el aumento en la frecuencia y tiempo de duración de las exploraciones subterráneas (Redolat et al, 2005). El extracto metanólico de M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg respecto al control, no produjo modificaciones estadísticamente significativas en la frecuencia y duración de las exploraciones subterráneas. Estos resultados confirman los obtenidos en la prueba de laberinto en cruz elevado en cuanto a que Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg carece de los efectos ansiolíticos que popularmente se le atribuyen. Bajo las mismas condiciones experimentales en las cuales se evaluó el potencial ansiolítico del extracto, el grupo tratado con diazepam respecto al control, aumentó de manera estadísticamente significativa la frecuencia y duración de las exploraciones subterráneas, lo que se interpreta como un efecto ansiolítico y coincide con lo demostrado por Kamei et al. (2001) y Takeda et al. (1998) quienes en sus trabajos han publicado que la administración de dosis no sedativas de diazepam (0,3 – 0,5 mg/kg) producen un aumento estadísticamente significativo en la frecuencia y tiempo de duración de las exploraciones subterráneas, interpretándose esto como efecto ansiolítico. Tanto el grupo tratado con el extracto (150 mg/kg i.p) como el grupo tratado diazepam (0,3 mg/kg i.p.) respecto al control, no modificaron la actividad motora en la prueba. Los resultados aquí obtenidos para el grupo tratado con diazepam coinciden con lo demostrado por Kamei et al. (2001) quien describe que diazepam en dosis de 0,1 – 0.56 mg/kg administrado vía intraperitoneal no modifica la actividad motora en la prueba. 58 En ambas pruebas el extracto de M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg no modificó de manera significativa respecto al control la actividad motora, sin embargo si lo hizo en la prueba de campo abierto con la cual se determinó la dosis de extracto a utilizar en el estudio. Estos resultados aparentemente contradictorios, podrían explicarse en el sentido que si bien las tres pruebas tienen en común el hecho de poder evaluar el comportamiento de un animal al ser expuesto a un ambiente novedoso, las pruebas de laberinto en cruz elevado y campo abierto con agujeros exponen al animal a un mayor número de estímulos ansiogénicos, por este motivo la ausencia de diferencias significativas respecto al control en estas pruebas podría asociarse a la incapacidad del extracto en esta dosis de revertir los niveles de ansiedad de los animales y no a un deterioro de la actividad motora. El efecto antidepresivo del extracto fue evaluado en la prueba de natación forzada. Aquí los animales son forzados a nadar en un cilindro lleno de agua del que no pueden escapar, después de un cierto tiempo, los animales adoptan una postura inmóvil ante la imposibilidad de escapar del estímulo estresante que se interpreta como un sensación de desesperanza similar a la presentada en la patología de la depresión (Reyes, 2000; Porsolt et al, 1977). En estas condiciones experimentales, las drogas antidepresivas como los tricíclicos, reducen el tiempo de inmovilidad produciendo en el animal un aumento en sus conductas activas, mientras que los ansiolíticos y neurolépticos son inactivos (Borsini y Meli, 1988). Entre los falsos positivos, se encuentran diversos anticolinérgicos y antihistamínicos, sin embargo, el hecho que la actividad antihistamínica y/o anticolinérgica pueda jugar un papel en la reversión de la depresión no puede descartarse, y de hecho se ha sugerido que pueden contribuir al efecto 59 antidepresivo de los tricíclicos (Onodera, 1991). M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg no presenta, respecto al control negativo, un efecto anti-inmovilidad estadísticamente significativo, esto nos indica que el extracto en estudio en esta dosis, carece de los efectos antidepresivos que popularmente se le atribuyen. Bajo las mismas condiciones experimentales, el grupo tratado con imipramina como droga de referencia, redujo de manera significativa respecto al control los tiempos de inmovilidad. Estos resultados coinciden con lo demostrado por Bhattamisra et al. (2008), Mora et al. (2005a) y Wei et al. (2008) respecto a que imipramina efectivamente produce un aumento de las conductas activas de los animales al ser sometidos a la prueba. El análisis fitoquímico de los componentes hidrosolubles en la droga permite descartar la presencia de saponinas, taninos y flavonoides, y confirmar la presencia de mucílagos, constituyentes frecuentes en la familia de las malváceas, que se utilizan como protectores en tejidos inflamados, especialmente en la mucosa intestinal, gástrica o bronquial por sus capacidades de formar soluciones viscosas de consistencia espesa (Montes, 1992). Además, las reacciones de identificación de hidratos de carbono revelaron la presencia de azúcares no reductores en la planta. Las reacciones de reconocimiento de alcaloides resultaron todas negativas, esto nos indica la ausencia de este tipo de metabolitos secundarios en la planta. Las reacciones de reconocimiento de heterósidos antraquinónicos y cardiotónicos (genina de 23 átomos de Carbono) resultaron igualmente negativas, lo que permite descartar la presencia de este tipo de compuestos en la droga en estudio. La reacción de Liebermann permitió evidenciar la presencia de, a lo menos, un compuesto con núcleo esteroideo en la droga en estudio, cuya presencia, en base a la bibliografía consultada, no había sido descrito en esta 60 especie. El núcleo esteroideo forma parte estructural de una gran variedad de compuestos, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en los reinos animal y vegetal. En las plantas superiores se hallan principalmente fitosteroles: β-Sitosterol, Campesterol y Estigmasterol, en las algas pardas el Fucosterol y en los hongos y levaduras se encuentra principalmente el Ergosterol. Debido a su gran diversidad estructural, no se le conocen a los esteroles naturales actividades biológicas específicas, debido a que varían dependiendo del tipo de sustituyentes que posea el núcleo base. Sin embargo asterosterol presente en se ha reportado en conejos la acción antipirética del Artemisia absinthium, se han reportado también esteroles citotóxicos como los encontrados en el alga roja Galaxaura marginata (Sheu et al, 1996). Menos estudiados son los esteroides diméricos y oligoméricos como las cefalostatinas altamente citotóxicas y por ende potenciales agentes antitumorales (Li y Dias, 1997). 5,7 En el caso de esteroles con núcleo −3−hidroxiandrostadieno como el ergosterol, estos son convertidos en vitamina D la cual desempeña un papel importante en el metabolismo de minerales como el calcio y fósforo y puede ser convertida en otros análogos hidróxilados que son activos contra la psoriasis y cáncer epitelial (Zhu y Okamura, 1995). Algunos compuestos esteroideos con grupos funcionales peróxido y epóxidos como los aislados del micelio del hongo Cordyceps sinensis presentan comprobadas propiedades antitumorales (Bok et al, 1999). El análisis cromatográfico (c.c.f) del extracto metanólico y clorofórmico de la droga utilizando como fase móvil una mezcla de acetato de etilo: metanol: agua (100:13,5:10) muestra una mancha de Rf 1,0 en ambos extractos, que observada bajo luz UV a 254 y 61 365 nm revela un color verde oscuro y rojo fluorescente respectivamente, que nos indica la presencia de compuestos con características polares en ambos extractos, que podrían corresponder a antraglicósidos, arbutina u otro tipo de compuestos afines (Hildebert y Sabine, 1996). El hecho de obtener en ambos extractos sólo una mancha de Rf 1,0 indica la presencia de compuestos con una marcada polaridad, pero también al no lograrse una separación es necesario valorar si la mezcla de disolventes orgánicos utilizados o la proporcionalidad entre ellos es la correcta a utilizar. El análisis cromatográfico (c.c.f) del extracto metanólico utilizando como eluyente una mezcla de tolueno: acetato de etilo (93:7) y observado bajo luz UV a 254 y 365 nm no muestra manchas en el cromatográma, en base a esto podemos inferir que este extracto carece de compuestos con propiedades lipofílicas o estos se encuentran en muy baja concentración. Utilizando la misma mezcla de solventes como fase móvil, se estudio el extracto clorofórmico de la planta, este mostró una mancha de Rf 0,47 que observada al UV a 254 y 365 nm se aprecia de color amarilla y rojo fluorescente, respectivamente, esta podría corresponder a cumarinas (Hildebert y Sabine, 1996). La diferencia creciente de polaridad entre el cloroformo y el metanol, junto al resultado obtenido al utilizar como eluyente una mezcla de solventes afines a compuestos apolares, permite deducir que en la planta existen uno o más compuestos con estas características, que están presentes en el extracto clorofórmico y ausentes o en muy bajas concentraciones en el extracto metanólico. Este hecho puede relacionarse con la ausencia de los efectos ansiolíticos y antidepresivos observados al evaluar el extracto de Modiola caroliniana y se explicaría por la no presencia en el extracto metanólico de la planta en estudio, de compuestos con características lipofílicas, requisito esencial 62 para que una molécula logre atravesar la barrera hemato-encefálica y pueda ejercer sus efectos en el sistema nervioso central (von Bernhardi, 2004). La identificación de compuestos con núcleo esteroideo en los extractos metanólico y clorofórmico se realizó también por medio de la separación por c.c.f seguido de la aplicación del reactivo de coloración de Liebermann-Burchard. Como muestra la tabla 10 al observar las placas al UV-Visible aparecen una serie de manchas a valores de Rf: 0,13 – 0,19 – 0,38 en el extracto metanólico y de 0,05 y 0,36 en el extracto clorofórmico de coloración verde esmeralda, que confirma la presencia de compuestos esteroideos (Hildebert y Sabine, 1992). Al observar las placas al UV-365 nm se aprecian tanto en el extracto metanólico como clorofórmico una serie de manchas rojo fluorescentes características de este tipo de compuestos a valores de Rf: 0,13 – 0,19 – 0,38 y 0,63 en el extracto metanólico y de 0,05 – 0,18 – 0,29 y 0,36 en el extracto clorofórmico. Por medio de esta técnica se confirma la presencia de compuestos esteroideos en la droga en estudio y se puede inferir que dos de estas manchas, que aparecen en ambos extractos, por la similitud en sus Rf podrían corresponder a los mismos compuestos. En el extracto metanólico aparecieron además otras manchas blancas no fluorescentes a valores de Rf: 0,75 – 0,88 y 0,94 y en el extracto clorofórmico a valores de Rf: 1,0. Estos podrían corresponder a principios amargos, terpenos, valpotriatos u otros compuestos afines (Hildebert y Sabine, 1996). Los extractos clorofórmico y metanólico también fueron revelados con el reactivo de Kedde como muestra la tabla 11 y observados al UV-visible. Ambos extractos una vez aplicado el reactivo sobre la cromatoplaca revelaron manchas de colores característicos a valores de Rf: 0,13 – 0,19 – 0,25 – 0,63 y 1,00 en el extracto metanólico y 0,31 – 0,36 63 en el extracto clorofórmico. Pero ninguna de estas manchas presentó un color rosado o azul-violeta lo que permite descartar la presencia de cardenólidos en ambos extractos y coincide con lo demostrado en el ensayo fitoquímico. 64 6. CONCLUSIONES • En base a los resultados obtenidos en los test conductuales, realizados bajo las condiciones experimentales anteriormente detalladas, podemos concluir que el extracto metanólico de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg, carece de los efectos ansiolíticos y antidepresivos que popularmente se le atribuyen en medicina tradicional mapuche. Se rechazan las hipótesis planteadas. • El análisis fitoquímico de Modiola caroliniana indica la presencia de azúcares no reductores, mucílagos y a lo menos un compuesto con núcleo esteroídeo. • El análisis cromatográfico permitió determinar la presencia de compuestos con características polares y lipofílicas en M. caroliniana. Mediante la aplicación del reactivo de coloración de Liebermann-Burchard sobre las cromatoplacas, se confirma la presencia de un compuesto esteroídeo en la planta en estudio, siendo necesarios la realización de otros ensayos químicos que permitan la caracterización detallada de este tipo de compuesto. . 65 7. LITERATURA CITADA • Alguacil, L.F., Álamo, C., Iglesias, V. (1996) Contribución de los estudios preclínicos al conocimiento y terapéutica de la depresión. Psicothema 8, 657667. • Alonso, J. (1988) Tratado de Fitomedicina. Ed. ISIS, Buenos Aires. 1039 pp. • Ariza, S., Rincón, J., Guerrero, M. (2006) Efectos sobre el sistema nervioso central del extracto etanólico y fracciones de Hygrophila tyttha Leonard. Revista Colombiana de Ciencias Químico-Farmacéuticas 35, 106-119. • Ariza, S., Rueda, D., Rincón, J., Linares, E., Guerrero, M. (2007) Efectos farmacológicos sobre el sistema nervioso central inducidos por cumarina, aislada de Hygrophila tyttha Leonard. 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