Transcript
REVISTA MEXICANA DE F´ISICA 50 SUPLEMENTO 1, 75–79
JUNIO 2004
Focalizaci´on autom´atica en microscop´ıa o´ ptica a trav´es de m´etodos de geometr´ıa fractal D. Calva M´endez, F. Manzano Licona y M. Lehman Software Integral para Laboratorio (SOFILAB) S.A. de C.V., Lisboa 14-A, Col. Ju´arez, M´exico D.F., 06600 M´exico e-mail:
[email protected] Recibido el 27 de marzo de 2003; aceptado el 24 de noviembre de 2003 Se estudia la relaci´on entre la dimensi´on fractal de im´agenes obtenidas por videomicroscop´ıa y la correspondiente focalizaci´on de la muestra. Este punto de vista es novedoso, pero tiene una ´ıntima relaci´on con otros m´etodos ya implementados. Se consideran diferentes casos: 1) im´agenes 2D de muestras biol´ogicas y superficies met´alicas; 2) im´agenes 3D con focalizaci´on en diferentes planos. Descriptores: Microscop´ıa o´ ptica; focalizaci´on autom´atica; dimensi´on fractal. The relationship between the fractal dimension of images obtained by video-microscopy and the corresponding focalization of the sample is studied. This point of view is novel, but it has an intimate relationship with other implemented methods. Different cases are considered: 1) 2D images of biological and metallic surfaces samples; 2) 3D images with focalization at different planes. Keywords: Optical microscopy; automatic focusing; fractal dimension. PACS: 42.30.Va; 5.45.Df; 07.60.Pb
1.
Introducci´on
Existen algunos m´etodos interesantes para focalizaci´on autom´atica de im´agenes de una muestra que pueden emplearse en microscop´ıa o´ ptica. Algunos ejemplos utilizan la entrop´ıa [1,2], la visibilidad local [3], el an´alisis estructural [4] o la distribuci´on de energ´ıa de la imagen [5]. En este u´ ltimo caso se resaltan los bordes de la estructura que se visualiza. Algunos de estos resultados pueden extenderse para ser utilizados en microscop´ıa 3D, por ejemplo, en el caso de algoritmos para calcular profundidad de foco [6,7]. Por otra parte, los m´etodos de an´alisis fractal de im´agenes demuestran una gran potencialidad, salvo que pueden emplearse realmente en un cierto intervalo definido por la distancia entre los elementos b´asicos de la imagen y el tama˜no de las estructuras componentes (en n´umero de tales pixels). Adem´as, dicho an´alisis fractal se aplica fundamentalmente a estructuras complejas, las cuales pueden describirse mediante m´etodos matem´aticos rigurosos [8] o a trav´es del producto de componentes m´as simples como son las funciones peri´odicas [9]. Sin embargo, se pueden encontrar aplicaciones interesantes en la ciencia de los materiales y biomedicina, que emplean el formalismo fractal para la interpretaci´on de algunos fen´omenos [10,11], por lo cual el an´alisis de im´agenes mediante el uso de tales geometr´ıas representa una interesante aplicaci´on en estos campos de la ciencia y la tecnolog´ıa. En el presente trabajo analizamos la relaci´on que existe entre la dimensi´on fractal, calculada a trav´es del m´etodo de “box-counting”, y la posici´on de focalizaci´on en im´agenes de estructuras complejas observadas en microscop´ıa o´ ptica. Los resultados obtenidos son muy promisorios para el empleo de este par´ametro en la focalizaci´on de la muestra para un equipo de microscop´ıa automatizado [12]. Se puede verificar, con algunos ejemplos, la variaci´on de las magnitudes involucradas y el error relativo de la medida para diferentes posiciones.
2.
Fundamentos te´oricos
La posibilidad de tratar como fractales algunos tipos de muestras en biolog´ıa y en ciencia de materiales, depende fundamentalmente del tipo de aproximaci´on que queramos hacer a los hechos reales. En las im´agenes que presentamos aqu´ı se muestran estructuras muy irregulares que pueden representarse mucho mejor a trav´es del tipo de geometr´ıa fractal. Como fundamento te´orico empleamos la funci´on entrop´ıa, que ya ha sido utilizada en diversas aplicaciones o´ pticas [13-16], y que nos permitir´a deducir la posici´on de focalizaci´on para un sistema o´ ptico. Como ejemplo de aplicaci´on consideramos las im´agenes capturadas por un microscopio o´ ptico automatizado [12] y verificamos los resultados generales con algunos ejemplos. 2.1.
Focalizaci´on de un sistema o´ ptico
En este trabajo partimos de la maximizaci´on de la entrop´ıa de Shannon, como base te´orica que permite establecer un criterio para la focalizaci´on de un sistema o´ ptico [2]. Dividimos la imagen, que se obtiene a la salida de tal sistema o´ ptico, en N 1 × N 2 celdas de informaci´on (siendo N 1, N 2 ≥ 1 pixel), las cuales est´an centradas en el punto (xi , yj ). Como se expone en en la Ref. 2, la entrop´ıa total se maximiza en un punto a lo largo del eje de propagaci´on z, esto es dS(z)dz = 0, S(z) =
siendo N1 X N2 X
IN (xi , yj ; z) log IN (xi , yj ; z), (1)
i=1 j=1
donde IN (xi , yj ; z) es la intensidad de la imagen en cada celda, normalizada con la intensidad total de la imagen. Entonces, debido a la conservaci´on de la energ´ıa total (o intensidad
´ D. CALVA MENDEZ, F. MANZANO LICONA Y M. LEHMAN
76
total) de la imagen y por ser IN (xi , yj ; z) una funci´on definida positiva, se llega finalmente a la condici´on N2 N1 X X ddz IN (xi , yj ; z) = 0 i=1 j=1
⇒ dIn (xi , yj ; z)dz = 0. (2) Esto significa claramente que, una condici´on general como la expresada en la Ec. (1) se transforma en una condici´on local como se muestra en la segunda igualdad de (2). Si definimos ahora las componentes de frecuencia espacial f = (µ, ξ) se tiene que µ=xi λz, ξ=yj λz ⇒ ddz≡df dz ddf f =(µ, ξ),
(3)
entonces, la Ec. (2) se convierte en dIN (xi , yj ; z)dz = dIN (f )df |xi ,yj = 0.
(4)
´ es el criterio de focalizaci´on, como aqu´ı lo utilizaremos, Este para cada celda de la imagen centrada en la posici´on (xi , yj ). Por otra parte, para poder hacer el tratamiento en el cual estamos interesados, consideramos en primer lugar el caso general de un sistema o´ ptico, como el mostrado en la Fig. 1, que sirve para tomar una imagen de una muestra M . Una expresi´on sencilla que se puede obtener por simples consideraciones geom´etricas [17] para el di´ametro de la porci´on de imagen defocalizada es d=
∆ , F
F =
Z , D
(5)
siendo F el f-n´umero del sistema, Z la distancia focal de la lente y d el campo de vista. Este resultado tambi´en queda justificado a partir del criterio de entrop´ıa m´axima [2]. En la Fig. 1, P representa el plano focal, es decir la posici´on donde la muestra estar´ıa correctamente focalizada. La Ec. (4) es una condici´on local, que se cumple para cada celda de la imagen. Esto significa que se podr´ıan considerar porciones de la imagen a trav´es de las celdas que contienen a la estructura que se desea focalizar. El n´umero de celdas que contienen la estructura focalizada (o que se desea focalizar) ser´a notado con N (f , δ) (donde δ es el tama˜no de cada celda) y con IE (k; f ) se denominar´a la intensidad total normalizada contenida en la celda k. La condici´on (4) tambi´en se puede escribir (para porciones de la estructura completa) como ¯ ¯ N (f ,δ) X ¯ d IE (k; f ) df ¯¯ = 0, ¯ k=1 xi ,yj
con el caso particular: IE (k; f ) = 1 ⇒ dN (f )df = 0, (6) para un ciero tama˜no de celda (δ) fijo. Entonces, cuando las intensidades correspondientes a la porci´on de estructura focalizada tomen valores discretos mediante una binarizaci´on
F IGURA 1. Defocalizaci´on en un sistema o´ ptico.
a valores 0 y 1, la condici´on de extremal se cumple para el n´umero de celdas que cubren la porci´on de imagen focalizada. 2.2.
Estructuras fractales
Un conjunto fractal puede ser definido como [18]: 1) aquel para el cual la dimensi´on de HausdorffBesicovich excede estrictamente a la dimensi´on topol´ogica; 2) una forma que, de alguna manera, est´a constitu´ıda por partes similares al todo. Aqu´ı utilizamos la dimensi´on fractal aplicada a diferentes casos de enfoque, relacionada con cada canal de color (rojo, azul y verde) [19], para mostrar el comportamiento de la dimensi´on de box-counting en diferentes casos [20]. De todas maneras, este m´etodo puede ser generalizado para cualquier tipo de estructura, sea fractal o no. A partir de la definici´on de dimensi´on generalizada introducida en las Refs. 21 y 22, dada mediante " # NP (f ,δ) q log [Pk ] Dg = 1q − 1 l´ım
δ→0
k=1
log(δ)
,
(7)
donde δ es el tama˜no (o lado, variable) de una celda cuadrada (o caja, para el m´etodo de box-counting) y Pk es una funci´on de medida de probabilidad sobre las cajas o celdas cuadradas en que se dividi´o la imagen. Esta ecuaci´on tiene que ver con el tipo de definiciones de dimensi´on fractal utilizada en Ref. 8, donde se emplean conjuntos o funciones de medida. En este caso la probabilidad es una funci´on de medida, y es
Rev. Mex. F´ıs. 50 S1 (2004) 75–79
´ AUTOMATICA ´ ´ ´ DE METODOS ´ FOCALIZACION EN MICROSCOP´IA OPTICA A TRAVES DE GEOMETR´IA FRACTAL
v´alida una definici´on del tipo dado en la Ec. (7) para la intensidad normalizada, la cual es tambi´en una funci´on de medida. Entonces, Pk = IE (k; z), N (f ,δ)
IT (f )=
X
[IE (k; z)]q ⇒ IT (f )=δ (q−1) DS (f ) ,
(8)
k=1
siendo IT (f ) la intensidad total de la estructura focalizada (contenida en las N (f , δ) celdas).
3.
Resultados obtenidos
El criterio generalmente aceptado para determinar el grado de focalizaci´on de un sistema es la energ´ıa relativa contenida en la imagen como funci´on de la frecuencia espacial. Cuando existe defocalizaci´on, elementos adyacentes de la imagen se ven borrosos o promediados juntos, debido a la p´erdida de altas frecuencias espaciales. Muchos detalles no se ven claros y las irregularidades aparecen con menores variaciones. Para nuestro caso, el m´etodo de box-counting [17,21] relaciona los niveles de intensidad en cada celda de la imagen con el tama˜no de las celdas consideradas. Estos niveles de intensidad IT (f ) son tomados en tonos de grises (o binarizados), ya que si la imagen es color se convierte a tonos de grises, o bien se analiza para cada canal, como ya la adelantamos. Entonces, para el caso de box-counting, con q = 0, se deduce a partir de la Eq. (8) que: IT (f ) = N (f )
77
la imagen original con los casos de una imagen desenfocada y otra movida. Utilizamos la definici´on de dimensi´on fractal, calculada para un cierto tama˜no de caja δ (variable). En este caso, la dimensi´on fractal depende de las frecuencias espaciales, tal como se puede ver en la Ec. (8), y su derivada est´a dada por ¯ ¯ 1 1 dIT (f ) ¯¯ dDb (f ) ¯¯ =− , (10) df ¯xi ,yj ln 10 IT (f ) log(δ) df ¯xi ,yj donde ahora no se ha tenido en cuenta el l´ımite (9) debido a la resoluci´on finita de la imagen [22]. De las Ecs. (9) y (10) se obtiene que habr´a un valor m´aximo cuando se dan las siguientes condiciones: ¯ dIT (f ) ¯¯ =0, df ¯xi ,yj ¯ ¯ dN (f , δ) ¯¯ dDb (f ) ¯¯ =0 ⇒ =0. (11) ¯ df df ¯xi ,yj xi ,yj En los resultados obtenidos, de aplicaci´on a ejemplos concretos, podremos observar claramente que la dimensi´on fractal tiene un valor m´aximo cuando existe enfoque. A partir de los puntos obtenidos en la gr´afica log(δ)− log N (f , δ), donde se cuentan el n´umero de celdas (o cajas) para diferentes valores de δ, se traza la recta por regresi´on, con lo cual se obtiene el error ε. La pendiente de esta recta es el valor de
entonces log N (f , δ) , (9) δ→0 log(δ)
dN (f )=δ −Db (f ) ⇒ Db (f )= − l´ım
donde f representa las frecuencias espaciales o´ pticas, Db (f ) es la dimensi´on fractal de box-counting y δ es un cierto tama˜no de caja. Esta es la ecuaci´on conocida para el m´etodo de box-counting y, teniendo en cuenta el resultado de la Ec. (6), nos da la idea que en el punto de entrop´ıa m´axima, o punto de focalizaci´on, la dimensi´on fractal de la imagen tambi´en debe tener un valor m´aximo. La obtenci´on de la dimensi´on fractal de una imagen por el m´etodo de box-counting se realiza gr´aficamente a partir del c´alculo de la pendiente de la recta que se obtiene en el plano log(δ)− log N (f , δ), como veremos a continuaci´on. 3.1.
Dimension fractal y focalizaci´on
Existen algunos trabajos que tratan sobre estudios de dimensi´on fractal en microscop´ıa [9,23,24]. La dimensi´on fractal est´a relacionada con las irregularidades que presenta una estructura, entonces, intuitivamente, se entiende que estas irregularidades aparecen m´as claras cuando la imagen est´a focalizada. Es de esperar que, en la posici´on de focalizaci´on, la dimensi´on fractal tome un valor m´aximo. Verificaremos esto para diferentes tipos de im´agenes. Para esto comparamos
F IGURA 2. C´alculo de la dimensi´on fractal y su error, para la imagen de una muestra, en diferentes casos: (a) focalizada, (b) con defocalizaci´on gaussiana, (c) con movimiento de la muestra.
Rev. Mex. F´ıs. 50 S1 (2004) 75–79
78
´ D. CALVA MENDEZ, F. MANZANO LICONA Y M. LEHMAN
4.
Conclusiones
En el presente trabajo se desarroll´o el fundamento te´orico que nos permite afirmar que, en el punto de focalizaci´on de un
F IGURA 3. Aplicaciones del m´etodo de box-counting en la imagen (con diferentes niveles de grises) de una superficie met´alica rugosa.
dimensi´on fractal de la imagen. Por ejemplo, en la Fig. 2 se analiza el caso de un gran n´umero de leucocitos con una alta magnificaci´on (400X). Se utiliza la binarizaci´on de la imagen para luego determinar la dimensi´on fractal y se ve la diferencia para los tres casos considerados. El resultado de la Fig. 2a es para la imagen enfocada, en la Fig. 2b se puede ver la imagen desenfocada (con diferente posici´on a lo largo del eje z del microscopio), y en la Fig. 2c se puede observar un desenfoque debido a movimiento de la muestra. Los c´alculos de dimensi´on fractal indican que tiene un valor m´aximo para la imagen enfocada, tal como se determin´o en la Ec. (11). En la Fig. 3 se ha aplicado el m´etodo al caso de una superficie met´alica (con 40X), calculando la dimensi´on fractal total para una imagen con niveles de grises. Nuevamente se observa que el valor de la dimensi´on fractal es mayor en la posici´on de enfoque de la muestra (ver Fig. 3a), si se compara con el correspondiente valor obtenido en uno de los casos de desenfoque (el cual se muestra en la Fig. 3b). En la Fig. 4 se estudia la irregularidad sobre una superficie biol´ogica, como es el caso de una naranja con una magnificaci´on de 40X, y se ve que existen varios planos de enfoque. Se ha descompuesto el color de la imagen en sus colores b´asicos (rojo, verde, azul), midiendo la dimensi´on fractal para el canal rojo. En la Fig 4a, el c´alculo se desarrolla para toda la imagen y luego se calcula la dimensi´on fractal para el sector que se corresponde con la segunda imagen, donde se focaliza otro plano. Este mismo proceso se repite para la Figs. 4b y 4c. Se observa que en tales sectores la dimensi´on fractal tambi´en toma un valor mayor cuando hay focalizaci´on. Esto significa que puede calcularse este par´ametro a nivel local y obtener igualmente buenos resultados a los fines de diferenciar planos de focalizaci´on. En todos los casos que hemos mostrado se puede verificar tambi´en que el error relativo (ε/D) es m´ınimo para la posici´on de focalizaci´on.
F IGURA 4. Diferentes planos de focalizaci´on para las irregularidades de una superficie biol´ogica y c´alculo de la dimensi´on fractal correspondiente para el color rojo.
Rev. Mex. F´ıs. 50 S1 (2004) 75–79
´ AUTOMATICA ´ ´ ´ DE METODOS ´ FOCALIZACION EN MICROSCOP´IA OPTICA A TRAVES DE GEOMETR´IA FRACTAL
sistema o´ ptico, la dimensi´on fractal de una imagen tiene un valor m´aximo. Se aplica este resultado al c´alculo de la dimensi´on fractal de una imagen obtenida por videomicroscop´ıa y la obtenci´on de la correspondiente focalizaci´on del sistema. Se demuestra que, cuando hay enfoque total o local (sobre una parte de la imagen), existe un m´aximo en el correspondiente valor de la dimensi´on calculada mediante box-counting. Adem´as, un m´etodo basado en geometr´ıa fractal engloba, en cierta forma, otros m´etodos de focalizaci´on mencionados y son, en alguna medida, m´etodos equivalentes. La ventaja del m´etodo presentado aqu´ı es que no es necesario calcular toda la energ´ıa dentro de la imagen, sino dentro de una o varias cajas de tama˜no δ, o efectuando c´alculos a nivel local. Esto brinda la posibilidad de obtener un algoritmo mucho m´as r´apido para enfocar la imagen en un equipo automatizado para microscop´ıa o´ ptica.
79
Si bien en el presente trabajo hemos empleado aplicaciones espec´ıficas a superficies met´alicas y biol´ogicas, se tiene contemplado en el futuro, y como aplicaci´on adicional, el estudio de profundidad de campo y la posibilidad de extender los resultados para microscop´ıa 3D.
Agradecimientos Este trabajo se desarroll´o con el apoyo de la empresa Software Integral para Laboratorio S. A. de C. V. (M´exico DF, M´exico) a trav´es del Proyecto de Investigaci´on y Desarrollo NeuroSofilab (Ref. SOF-971021-I75/2001-1) aprobado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog´ıa (CONACyT) y la Secretar´ıa de Hacienda y Cr´edito P´ublico (M´exico).
1. C. Thum, Opt. Acta 31 (1984) 203.
13. M. A. Porras y R. Medina, Appl. Opt. 34 (1995) 8247.
2. R. Torroba, V. Climent y P. Andr´es, Optik 107 (1997) 39. 3. P. Torroba, N. Cap y H. Rabal, J. Mod. Opt. 41 (1994) 111.
14. E. Alberdi, M. Lehman, R. Torroba y M. Garavaglia, Optics Comm. 175 (2000) 1.
4. C. Dahne y F. Lanzel, Optik 55 (1980) 437.
15. M. Lehman, Optik 107 (1997) 73.
5. L.F. McKeogh, J.P. Sharpe y K.M. Johnson, Meas. Sci. Technol. 6 (1995) 583.
16. F.T.S. Yu, Entropy and Information Optics (Marcel Dekker, Inc., New York, 2000).
6. A.G. Valdecasas, D. Marshall, J. M. Becerra, Microscopy and Analysis 56 (2002) 11.
17. M. Born y E. Wolf, Principles of Optics: Electromagnetic Theory of Propagation, Interference and Diffraction of Light (Cambridge University Press, Cambridge, 1999).
7. H.S. Wu, J. Barba y J. Gil, J. Microscopy 184 (1996) 133. 8. Y.B. Pesin, Dimension theory in dynamical systems (The University Chicago Press, Chicago, USA, 1997). 9. M. Lehman, Optics Comm. 195 (2001) 11. 10. J.C. Russ, Fractal surfaces (Plenum Press, New York, 1994). 11. G.A. Losa, D. Merlini, T.F. Nonnenmacher y E.R. Weibel, eds., Fractals in biology and medicine (Birkh¨auser, Basel, Suiza, 1998). 12. A. Landa Quezada, D. Calva M´endez, M. Lehman, Memorias del XXV Congreso Nacional de Ingenier´ıa Biom´edica (Monterrey, M´exico, 2002) 92.
18. J. Feder, Fractals (Plenum Press, New York, 1989). 19. M.F. Barnsley y L.P. Hurd, Fractal image compression (AK Peters, Ltd., Wellesley, Massachusetts, USA, 1993). 20. S. Kyriacos, S. Buczkowski, F. Nekka y L. Cartilier, Fractals 2 (1994) 321. 21. P. Grassberger, Phys. Lett. A 97 (1983) 227. 22. J. Theiler, J. Opt. Soc. Am. 7 (1990) 1055. 23. K. Sandau y H. Kurz, J. Microscopy 186 (1997) 164. 24. J.C. Russ, J. Comp. Assisted Microscopy 3 (1991) 127.
Rev. Mex. F´ıs. 50 S1 (2004) 75–79