El Colegio De La Frontera Sur

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El Colegio de la Frontera Sur Factores asociados a infecciones por Virus del Papiloma Humano en mujeres de comunidades de muy alta marginación de la Región Norte de Chiapas TESIS Presentada como requisito parcial para optar al grado de Maestría en Ciencias en Recursos Naturales y Desarrollo Rural Por José Ricardo Hernández Gómez Agosto 2008. Índice general RESUMEN ............................................................................................................. 4 AGRADECIMIENTOS .............................................................................................. 5 DEDICATORIAS .................................................................................................... 7 ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................. 8 ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................ 8 I.- INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 9 II.- MARCO TEÓRICO ...................................................................................... 11 II.1 II.2 II.3 II.4 II.5 II.6 II.7 II.8 II.9 INFECCIONES DE TRANSMISIÓN SEXUAL ........................................................... 11 EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH) COMO INFECCIÓN DE TRANSMISIÓN SEXUAL 12 ASPECTOS VIROLÓGICOS DEL VPH................................................................. 13 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DEL VPH........................................................... 13 VPH Y EL CÁNCER CÉRVICOUTERINO (CACU) ................................................... 14 FACTORES ASOCIADOS AL CACU ................................................................... 16 EL CACU: UNA ENFERMEDAD DE LA POBREZA Y LA FALTA DE DESARROLLO ................ 16 FACTORES ASOCIADOS A VPH ...................................................................... 17 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE VPH ........................................................ 18 III.- JUSTIFICACIÓN ........................................................................................ 19 IV.- OBJETIVOS ............................................................................................... 21 IV.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................... 21 IV.1.1 Objetivos específicos ....................................................................... 21 IV.2 PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN .................................................................... 21 V.- MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................... 22 V.1 ÁREA DE ESTUDIO ..................................................................................... 22 V.2 CARACTERÍSTICAS DE LOS MUNICIPIOS ESTUDIADOS........................................... 23 V.2.1 Municipio de Simojovel ....................................................................... 23 V.2.2 Municipio Huitiupán ............................................................................ 23 V.3 ASPECTOS MUESTRALES .............................................................................. 24 V.3.1 Obtención de muestras para identificación de VPH ................................ 25 V.3.1.1 Obtención y transporte de raspados cervicales para la identificación de VPH ................................................................................................. 26 V.3.2 Procesamiento de muestras en laboratorio ........................................... 27 V.3.2.1 Extracción de ADN ...................................................................... 27 V.3.2.2 Amplificación de ADN viral por PCR ............................................... 29 V.3.2.3 Genotipificación de VPH por RFLPs ............................................... 31 V.4 ANÁLISIS DE DATOS ................................................................................... 33 V.4.1 Variables incluidas .............................................................................. 33 V.4.2 Análisis de las variables ...................................................................... 34 V.4.3 Asociación de variables ....................................................................... 34 V.4.3.1 Creación de un Modelo estadístico de Regresión Logística............... 35 VI.- RESULTADOS ............................................................................................ 36 VI.1 POBLACIÓN DE ESTUDIO ............................................................................. 36 VI.1.1 Características generales de mujeres que se les tomaron muestra para VPH ..................................................................................................... 36 VI.1.1.1 Características sociodemográficas ................................................. 37 2 VI.1.1.2 Características ginecoobstétricas .................................................. 38 VI.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS ............................................................... 39 VI.3 PREVALENCIA Y POSITIVIDAD DE VPH ............................................................ 39 VI.3.1 Genotipos encontrados.................................................................... 39 VI.3.1.1 Clasificación de los genotipos ....................................................... 40 VI.4 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE MUJERES QUE LLEGARON DE MANERA VOLUNTARIA .......... 41 VI.5 FACTORES ASOCIADOS A VPH ...................................................................... 41 VI.5.1 Factores sociodemográficos ............................................................. 42 VI.5.2 Factores ginecoobstétricos............................................................... 43 VI.6 AJUSTE DE ORS POR UN MODELO DE REGRESIÓN LOGÍSTICA ................................ 44 VII.- DISCUSIÓN............................................................................................... 46 VII.1 VII.2 VII.3 VIII.- COMPARACIÓN DE LA PREVALENCIA DE VPH CON LA REPORTADA EN OTROS ESTUDIOS. 46 GENOTIPOS IDENTIFICADOS ......................................................................... 47 FACTORES ASOCIADOS A VPH ...................................................................... 48 CONCLUSIONES .................................................................................... 51 IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 52 X.- ANEXOS ................................................................................................... 59 X.1 ANEXO 1. CUESTIONARIO DE “HOGARES”. ....................................................... 59 X.2 ANEXO 2. CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO. .......................................... 64 X.3 ANEXO 3. TÉCNICA DE EXTRACCIÓN DE ADN: FENOL-CLOROFORMO-ALCOHOL ISOAMÍLICO........................................................................................................ 65 3 Resumen El virus del papiloma humano (VPH), es causa de una de las infecciones de transmisión sexual más comunes y se ha identificado en casi el 99% de los casos de cáncer cérvicouterino (CaCU). Existen factores relacionados con las infecciones por VPH, que van desde los inmunológicos, hasta las barreras al acceso a los servicios de salud. Se identificaron los factores asociados a infecciones por VPH en comunidades de alta marginación socioeconómica. Se realizó un muestreo en mujeres de comunidades de la Región Norte del estado de Chiapas. La muestra consistió en un raspado cervical para la identificación de VPH por medio de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se aplicó un cuestionario para obtener datos sociodemográficos y ginecoobstétricos de las mujeres participantes. La prevalencia estimada de VPH fue de 15.2%. El genotipo más frecuente identificado fue el 31 (13%). El 45% se identificó como de alto riesgo a CaCU y el 28% fue de bajo riesgo. Se observó una asociación de cuatro veces mayor de riesgo de adquirir una infección por VPH, entre las mujeres que viven en comunidades rurales y las de comunidades urbanas. Además de 2.8 veces mayor riesgo entre las mujeres con algún grado de escolaridad y las que no tenían algún grado. En este estudio el inicio de vida sexual, el número de parejas, de embarazos y de partos, así como la utilización de métodos de planificación familiar, no fueron factores asociados a la infección por VPH. La prevalencia de VPH en este estudio, se encuentra a similar nivel de otros estudios realizados en el país. La ruralidad y la escolaridad fueron factores de riesgo a una infección por VPH, y que a su vez, pueden estar relacionados con algún factor migratorio. Por lo que sugiere mayor vigilancia por los sistemas de salud en estos grupos, ya que los genotipos virales que están siendo transmitidos son de alto riesgo a desarrollar CaCU. Palabras clave: Virus del papiloma humano (VPH), cáncer cérvicouterino (CaCU), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), factores de riesgo, marginación, Chiapas, México. 4 Agradecimientos Al Dr. Héctor Ochoa Díaz-López, por ser parte importante en mi formación académica y personal. Por la oportunidad de trabajar y aprender de su valiosa experiencia en el transcurso de estos años bajo su dirección, además de la confianza depositada en mí en los proyectos realizados, pero sobre todo por su invaluable amistad. Al Dr. Eduardo Espinoza Medinilla, por su valiosa contribución con sus conocimientos en laboratorio, revisión de este trabajo de investigación. Pero sobre todo por su valiosa amistad, confianza y apoyo incondicional en todo momento. Gracias por sus acertados consejos, que han contribuido a mi formación. Al Dr. Héctor Javier Sánchez Pérez, por la disponibilidad de tiempo siempre mostrada para la revisión y corrección a este documento y por sus consejos y amistad que contribuyeron a la culminación de este documento. A la Dra. Consuelo Lorenzo Monterrubio, por su valiosa aportación a este trabajo, mediante sus correcciones y sugerencias, sus atinados consejos en todo momento. Al Dr. Crispín Herrera Portugal, por la revisión, consejos y sugerencias realizadas al documento y ser parte de mi formación profesional. A la Dra. Georgina Sánchez Ramírez, por su siempre profesionalismo y disponibilidad en la revisión del documento, así como por su valiosa confianza depositada en mí. Al Colegio de la Frontera Sur, por la beca otorgada y pertenecer a la generación de maestría. Al Ing. Roberto Solís por su apoyo en la realización de la base de datos y análisis estadístico para la realización de este documento. Principalmente por contar con su apoyo incondicional y amistad en todo momento. A la Biol. Maricela García Bautista, por su apoyo técnico, capacitación en la implementación de técnicas de laboratorio para el procesamiento de muestras del presente estudio. Además de su valiosa amistad y compañerismo. Al C.P. Uriel Ramos, por su apoyo administrativo en las cotizaciones y requisiciones de compra de material y equipo para este proyecto, así como su compañerismo y amistad. A Lic. Rosario García, por todo el apoyo, consejos y facilidades de áreas de trabajo para la realización de esta tesis. 5 Al Dr. Sergio López Mendoza, por sus consejos en los análisis estadísticos y por contar con su apoyo y amistad en todo momento. A Hermilo Cruz, por su colaboración y apoyo en la búsqueda de material bibliográfico. Al LCE. Diego Díaz de LAIGE, por su contribución en la elaboración del mapa para la presente tesis. A Raymundo Mijangos y Manuel Zepeda, por su apoyo técnico de cómputo y facilidades de equipo durante el desarrollo de la maestría. A las encuestadoras y tomadoras de muestras del proyecto en especial a: Naty, Margarita, Petrona y Estela. A mis compañeros y amigos de la generación 2006-2007, por todos los momentos y experiencias compartidas y hacer de este paso, algo inolvidable. Al personal y amigos de Ecosur: Don Agustín, Don Manuel Laux, Doña Manuelita, Marco Tulio, Doña Mechita, Don Nico, Doña Marce, Doña Rocío. Jorge Bolaños, Juan Carlos. A mis amigos: José Luís, Marco Antonio, Sergio Alejandro, Néstor, Bárbara, Simona, Yari, Marta, Daniel, Mercedes, Edgar, Juan Carlos y a todos y cada uno de los que estuvieron conmigo y me ofrecieron su incondicional apoyo. 6 Dedicatorias Especialmente para ti Mamá, que me has apoyado en todo momento, con tu inagotable paciencia y cariño para no dejarme vencer. Por todas tus enseñanzas y consejos que han hecho que culmine con una etapa más de mi vida. Te amo. Con todo mi amor y cariño, a ti Mary y mi Pequeñín, que han sido fuente de inspiración en todo momento, para avanzar y vencer lo obstáculos que se me han presentado. Gracias por todo el cariño y comprensión incondicional que me han brindado y ser mi razón de ser. A mi Papá y a mis hermanos: Isela y Sergio, por se parte fundamental en mi vida, por el cariño y comprensión siempre obtenida de ustedes, además de ser una motivación para continuar en mi andar. 7 Índice de figuras Págs. Figura 1 Prevalencia de la infección por VPH, las lesiones precancerosas y el cáncer cérvicouterino, por edad de las mujeres (Adaptada de la OMS, 2006)……………………………………………………….……………....…………………….. 12 Figura 2 Mapa de los municipios de área de estudio………………………………………….. 21 Figura 3 Diagrama de raspado cervical para la toma de muestra para VPH..................................................................................................... 24 Figura 4 ADN extraído de células cervicales en gel de agarosa al 1%..................... 25 Figura 5 Gel de agarosa al 1.5%. Muestras de VPH. Carril 1: ladder 100 pb, carril 2: muestra positiva de VPH (450 pb). Carril 3: muestra positiva a Bglobina. Carril 4: control positivo (VPH+ β-globina). Carril 5: control negativo............................................................................................... 28 Figura 6 Corrimiento de productos de la digestión por enzimas de restricción por la técnica de RFLP de producto de PCR en gel de acrilamida al 30%. Carril 2: Bam HI. Carril 3: Dde I. Carril 4: Hae III. Carril 5: Hinf I. Carril 6: Pst I. Carril 7: Rsa I. Carril 8: Sau 3AI. Carriles 1 y 9: ladder 100 pb…………………………............................................................................ 29 Figura 7 Distribución general de la edad de la mujer en años……………..……………… 35 Figura 8 Distribución de la edad de inicio de vida sexual en años.......................... 36 Figura 9 Distribución de genotipos encontrados según el riesgo a cáncer……………………………………………………………………………………………… 39 Índice de cuadros Págs. Cuadro 1 Descripción de variables en el estudio…………………………………… 30 Cuadro 2 Genotipos encontrados y clasificación según riesgo. A=alto riesgo, B=bajo riesgo, NC= No clasificado…………………………….. 37 Cuadro 3 Variables sociodemográficas………………………………………………... 42 Cuadro 4 Variables ginecoobstétricas………………………………………………….. 42 8 I.- Introducción El Virus del Papiloma Humano (VPH) es causante de una de las infecciones sexualmente transmitidas más comunes alrededor del mundo (Ho et al., 1998). Sin embargo, es escasamente conocida entre la población general y por parte de las instituciones de salud pública. La evidencia se ha enfocado a las mujeres, pero la mayoría de los hombres son portadores asintomáticos y se tiene un alto porcentaje de desconocimiento entre los varones (51% desconoce la enfermedad, especialmente la forma de transmisión y sus consecuencias) (Argüello et al., 2004; Stine 1999). Durante la década de los 90, estudios epidemiológicos basados en tecnología molecular, aportaron evidencia del papel de las infecciones por VPH en el desarrollo de cáncer cervical (Bosh et al., 2002; Bosh 2003) ya que muchos estudios en todo el mundo confirmaban que ciertos tipos genéticos de VPH, actuaban como causa necesaria para el desarrollo de cáncer cérvicouterino (CaCU) (Burd, 2003; Lewis, 2004). A partir de estos hallazgos, se han identificado más de 100 tipos de VPH relacionados con padecimientos a nivel de mucosas, que pueden infectar mucosa oral, rectal, vaginal y cervical (Qu et al., 1997). De estos tipos virales, 40 se relacionan con afecciones en la mucosa genital, causando lesiones intraepiteliales, y sólo algunos están relacionados con el CaCU (Balakrishnan et al., 2006), por lo que se han clasificado en dos grandes grupos: de bajo y alto riesgo, según su asociación encontrada con el CaCU y lesiones neoplásicas (León, 2005; Muñoz et al., 2003). En el ámbito mundial, se ha encontrado una frecuencia del 99.7% de VPH de alto riesgo en los carcinomas cérvicouterinos, siendo los genotipos 16 y 18 los de mayor frecuencia asociados al CaCU (Lewis, 2004). Diferentes estudios han sugerido que existen factores asociados que favorecen la infección y persistencia del VPH, tales como: edad, nivel socioeconómico, acceso a los sistemas de salud, características ginecoobstétricas, de comportamiento sexual, antecedentes de consumo de 9 tabaco y predisposiciones genéticas e inmunológicas (León, 2005; Brabin, 2002, Tirado et al., 2005), por lo que cada país o sociedad posee un contexto diferente, con distintas formas de asociación de los factores de riesgo. Aunado a esto, la prueba rutinaria de tamizaje Papanicolaou (Pap) posee diversas limitaciones para la detección del virus, como la poca sensibilidad de detectar infecciones en etapas tempranas. El acceso a las pruebas de detección por medio de herramientas moleculares con una mayor especificidad y sensibilidad, son aún limitadas a la población en general, principalmente en comunidades rurales de difícil acceso geográfico. Con base en lo anterior, a través de este estudio se pretendió identificar posibles factores asociados a la infección por VPH,1 en mujeres de comunidades rurales y urbanas, principalmente indígenas, de la zona Norte del estado de Chiapas, debido a que este tipo de mujeres son de las más aisladas a los sistemas de detección oportuna y de salud. La finalidad fue identificar grupos de riesgo y poder realizar propuestas para su mejor atención temprana y con ello, contribuir en la disminución de la alta tasa de infección por VPH y en consecuencia, en la disminución de la elevada tasa de mortalidad por CaCU que presenta el estado de Chiapas. El virus se identificó mediante una técnica sensible y específica para la detección del virus, denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). 1 10 II.- Marco teórico II.1 Infecciones de transmisión sexual Las infecciones de transmisión sexual (ITS) representan un grupo de padecimientos que se adquieren, tal como su nombre lo indica, principalmente por contacto sexual. Algunos de éstos (como el VIH/SIDA) son considerados como de notificación obligatoria en la mayoría de los países y continúan teniendo una inaceptable alta frecuencia, fundamentalmente entre la población joven en edad reproductiva y con vida sexual activa (Cuevas et al., 2003). Las ITS pueden producir síntomas en los órganos reproductivos, así como la piel alrededor de la vagina, el pene o el ano, y algunas también pueden causar síntomas sistémicos, produciendo problemas como lesiones y mal funcionamiento en otros órganos del cuerpo. Entre las ITS más comunes se encuentran al herpes genital, las causadas por Chlamydia trachomatis, verrugas venéreas, vaginitis, sífilis, gonorrea, hepatitis B, las producidas por el Virus del Papiloma Humano y el Virus de Inmunodeficiencia Adquirida (VIH) (González 1997, Stine 1999). Las ITS no están distribuidas de manera uniforme entre la población en general, es decir, solo algunos grupos específicos poblacionales son los que se encuentran en mayor riesgo de adquirirlas o transmitirlas. Muchos de estos grupos aún no han sido reconocidos, como son los de mayor marginación socioeconómica y con diferencias culturales como el lenguaje, a los que deben ser incluidos en los programas de vigilancia y control. Existen grupos de individuos que sufren con mayor frecuencia las complicaciones de las ITS, como por ejemplo, las mujeres que inician su actividad sexual a edad temprana, principalmente entre los 15 y 20 años de edad, además las que tienen varias parejas en lapsos cortos de tiempo, entre otros (Cuevas et al., 2003; Flores et al., 2003). 11 Se han identificado varios factores que están relacionados con el riesgo de adquirir una ITS entre la población, entre los principales son: el desarrollo de diversas infecciones a temprana edad (en personas menores de 20 años), tener relaciones sexuales sin ningún medio de protección y ser biológicamente más susceptibles a la infección. En estos grupos existe mayor posibilidad de contraer una ITS con curso clínico asintomático; aunado a esto, la estigmatización de este tipo de enfermedades, con la consecuente renuencia a solicitar atención médica. Por otra parte, los diagnósticos y los tratamientos erróneos (muchos de ellos sin un certero diagnóstico etiológico de la infección) y la falta de vigilancia epidemiológica en pareja, entre otros aspectos, conlleva a tener complicaciones tempranas o tardías (algunas de ellas letales) durante la vida sexual de la persona que las padece (Bosh et al., 2002; Cuevas et al., 2003; Jaimes, 1999). II.2 El Virus del Papiloma Humano (VPH) como infección de transmisión sexual El VPH es causante de una de las ITS más frecuentes en todo el mundo, pueden producir formaciones llamadas condilomas perineogenitales que se encuentran con cierta frecuencia en la población general. Este condiloma se define como una formación acuminada o como una carnosidad suave de aspecto de “coliflor” que es característico del virus. En el hombre, estas formaciones se localizan en la uretra terminal, el glande, prepucio, recto y margen anal. En la mujer se sitúan entre los labios mayores y menores, en la vagina y cérvix (Bosh et al., 2002; Cuevas et al., 2003). La infección por VPH es inicialmente asintomática y la transmisión puede ocurrir antes que la expresión del virus se manifieste. Para el completo desarrollo y crecimiento del virus es necesario un epitelio diferenciado preferentemente de piel y mucosas. Traumas o erosiones epiteliales antes de la infección, son factores locales importantes que favorecen el crecimiento viral, siendo poco el acceso a las células basales, donde produce un amplio espectro de cambios morfológicos una vez infestadas (León, 2005). 12 II.3 Aspectos virológicos del VPH Los VPH comprenden un grupo de virus no envueltos, de ADN, con un genoma de aproximadamente 8 000 pares de bases, con simetría icosaédrica. Pertenece a la familia Popovaviridae que consta en dos géneros: los Polyomavirus y los Papillomavirus, éstos últimos producen papilomatosis cutáneas y otras proliferaciones epiteliales en sus hospederos, que incluyen humanos, conejos, perros, ovejas y caballos. Dentro de los Papillomavirus, se encuentran los virus que afecta a humanos (VPH) o Alfa papilomavirus, de los que han sido identificados más 100 tipos que inducen verrugas o papilomas; de éstos, aproximadamente 40 pueden infectar mucosas de órganos genitales. Cada tipo es asociado preferentemente con una lesión clínica especifica y con un sitio anatómico preferencial por cada epitelio escamoso, mucosal o cutáneo. Así por ejemplo, el VPH-1 y VPH-4, están relacionados con verrugas y lesiones en la piel (Law et al., 1979; Stewart et al., 1996; León, 2005). II.4 Aspectos epidemiológicos del VPH El VPH genital es una ITS que es escasamente conocida por parte de la población en general y de las instituciones en salud pública, ya que en muchas ocasiones es asintomática y por la dificultad de detectarlo en sus fases tempranas. Además, la información sobre el VPH se ha enfocado principalmente a las mujeres; en el caso de los hombres, cuando llegan a infectarse, generalmente son portadores que no manifiestan signos clínicos y desconocen la forma de transmisión y sus consecuencias (Argüello et al., 2004; Stine, 1999). Sin embargo, a través de estudios realizados en los últimos años, la infección por VPH es considerada como un importante problema de salud pública en México, con una incidencia global anual mayor a 25 casos por cada 100,000 mujeres, con una mayor frecuencia en el grupo de edad entre 20 y 39 años, con más de un caso por cada 1,000 del grupo (Hernández et al., 2006). Es precisamente en este grupo de edad, que se multiplicó diez veces en los 13 últimos cinco años; sin embargo, la incidencia máxima de las infecciones, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se encuentra entre los 16 y 20 años (OMS 2006). II.5 VPH y el Cáncer Cérvicouterino (CaCU) En los últimos años, la ITS por VPH ha mostrado una particular importancia, ya que se ha confirmado que ciertos tipos genéticos de VPH actúan como causa necesaria para el desarrollo de cáncer cérvicouterino (CaCU), ya que provoca el 99.9% de los casos de cáncer uterino (Qu et al., 1997; Burd 2003; Lewis 2004; OMS 2006). El reconocimiento de la infección y de ciertos tipos de virus como causa necesaria del CaCU, ha conducido a nuevas investigaciones destinadas a su prevención. Las pruebas de ADN del VPH han mostrado ser una herramienta prometedora con gran sensibilidad y especificidad (Bosh et al., 2002; Castañeda et al., 1998; Muñoz y Bosh, 1996). Con estas técnicas se ha podido demostrar que sólo una pequeña fracción de mujeres infectadas con VPH eventualmente progresan a lesiones intraepiteliales de alto riesgo y carcinoma in situ. De manera general, las infecciones por VPH ceden espontáneamente y el pico de incidencia de infección por el virus ocurre entre los 16 y 20 años de edad. Cuando persisten, estas infecciones, llegan a producir lesiones en el cuello uterino que, al no ser tratadas, pueden evolucionar y llevar a un cáncer cervical en un lapso de 20 a 30 años (Lewis 2004). Sin embargo, los cambios precancerosos pueden ser detectados durante un periodo de infección persistente en fases tempranas (Figura 1) (Lewis 2004; OMS 2006). Debido a que no todas las infecciones por VPH evolucionan a CaCU, los tipos virales se han clasificado en dos grandes grupos: bajo y alto riesgo, según su asociación encontrada con el CaCU y lesiones neoplásicas. De esta forma, además del VPH-16 y el VPH-18 (que son los más frecuentes), estudios recientes han ampliado la lista de los virus denominados “oncogénicos” o de 14 “alto riesgo” por su gran potencial carcinogénico, a los tipos: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 68, 82. Mientras que los de bajo riesgo, que usualmente causan verrugas benignas y que ocasionalmente se asocian con lesiones invasivas, son: VPH 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81 y CP6108, éste último considerado dentro de los más frecuentes causantes de verrugas (Muñoz et al., 2003; León 2005; Balakrishnan et al., 2006). El VPH-16 aparece fundamentalmente en los tumores invasivos y en los de alto grado de malignidad; el VPH-18 generalmente se relaciona con el carcinoma (León, 2005). Figura 1. Prevalencia de la infección por VPH, las lesiones precancerosas y el cáncer cérvicouterino, por edad de las mujeres (Adaptada de la OMS, 2006). Dentro de los de “alto riesgo”, los tipos 16 y 18 son los de mayor frecuencia. El VPH-16 es principalmente identificado en mujeres de América Latina y el Caribe (OMS 2006). Además algunas variantes del VPH se relacionan más a menudo con neoplasias invasoras. En México, casi el 25% de los cánceres cérvicouterinos se atribuyeron a variantes asiáticoamericanas del VPH 16 (Lewis 2004). 15 II.6 Factores asociados al CaCU De acuerdo con estudios epidemiológicos realizados, se ha revelado que la mayoría de los cánceres están asociados a factores ambientales y sociales. Hay una gran variación en la incidencia de muchos cánceres entre un lugar y otro, que varían de frecuencia según el grupo social, la actividad y los hábitos de vida de las personas (Gariglio y Rangel, 1992), y el CaCU no es la excepción. Entre los factores asociados al CaCU, se encuentran: la infección por VPH, los hábitos sexuales (antecedentes de dos o más parejas y el inicio de vida sexual a edad temprana), algunos factores de riesgo reproductivo en la mujer (como la multiparidad y el consumo de anticonceptivos de tipo hormonal), el hábito tabáquico, y el alto índice de migración, que se relaciona con una mayor actividad sexual con mayor número de parejas sexuales y con prácticas sin protección, principalmente sin la utilización del condón (Hernández et al., 1998; Salmerón et al., 1997). II.7 El CaCU: una enfermedad de la pobreza y la falta de desarrollo En países con altos ingresos económicos o desarrollados, la morbilidad y mortalidad por cáncer cervical ha decrecido sustancialmente durante los últimos 50 años, debido principalmente a programas de detección oportuna basados en citología exfoliativa cérvicovaginal, que consiste en realizar un raspado para obtener células de endo y exocérvix, a partir del cual se hace un extendido en una laminilla y se tiñe con la técnica de Papanicolaou, para hacerlas visibles al microscopio y buscar diferenciación celular (Franco et al., 2003). Sin embargo, el cáncer cérvicouterino es aún la segunda causa de mortalidad por cáncer en mujeres a nivel mundial, ya que en muchos países en vías de desarrollo o de bajos ingresos, como es el caso de México, el programa de detección oportuna de cáncer basado en citología que se realiza desde hace tres décadas, no está siendo implementado correctamente o tiene importantes fallas, por lo que no se han podido reducir las elevadas tasas de CaCU (Castañeda et al., 1998; Franco 16 et al., 2003). Lo anterior se refleja en los resultados pobres del Programa Nacional de Detección de Cáncer que no ha sido exitoso en México, lo que puede atribuirse a la baja disponibilidad, accesibilidad, cobertura y calidad de los servicios, aunque también han contribuido algunos factores poblacionales, como barreras culturales, socioeconómicas y demográficas (Ochoa et al., 2006). El cáncer cervicouterino se considera una enfermedad de la pobreza debido a que la incidencia y mortalidad a causa de esta enfermedad, está relacionada al acceso limitado a los servicios de salud, vivir en zonas rurales y a los bajos niveles de educación (Lewis, 2004). Esto se confirma con las altas tasas de incidencia y mortalidad por CaCU en grupos de población con niveles socioeconómicos bajos. Por lo tanto, en países pobres con deficientes programas de detección de CaCU, la incidencia de esta enfermedad llega a ser hasta 15 veces más alta que la de los países industrializados (Palacio et al., 2003). II.8 Factores asociados a VPH A partir del reconocimiento del VPH como causa necesaria para el desarrollo de CaCU y del conocimiento del comportamiento y de las técnicas de detección del VPH, se han realizado estudios que sugieren la intervención de otros factores para el desarrollo del CaCU y que favorecen la infección y persistencia de VPH. Uno de estos factores es la multiparidad, donde mujeres con siete o más embarazos tienen un riesgo de padecer una infección por VPH, y cuatro veces más que las mujeres nulíparas o con menor número de hijos. Asimismo, se ha observado que el riesgo a una infección por VPH, aumenta conforme la edad es menor en su primer embarazo (León, 2005). Con lo que se refiere a la utilización de métodos anticonceptivos hormonales, se ha demostrado que éstos influyen en la susceptibilidad y predisposición de enfermedades en el tracto genital e intervienen en varios mecanismos inmunológicos (Brabin, 2002). También un mayor número de parejas sexuales aumenta la probabilidad de contagio de VPH (León, 2005). Por otra parte, un 17 nivel bajo de ingresos y un menor número de años de escolaridad y analfabetismo, son factores condicionantes para no participar oportunamente en los programas de detección a través de la citología cérvicovaginal y por consiguiente, se reduce significativamente la detección del VPH (Hernández et al., 2002). Sin embargo, el análisis de este tipo de factores es escaso en México y, tal como ya se mencionó anteriormente, cada país posee un contexto diferente, con distintas formas de asociación de los factores involucrados en la infección por el VPH. II.9 Diagnóstico de laboratorio de VPH Para la determinación del VPH, existen diferentes tipos de técnicas: las serológicas, las cuales tienen muchas limitaciones para fines clínicos debido a la gran variedad de subtipos humanos que presenta el virus, dando reacciones cruzadas entre diversos genotipos, ya que la expresión del VPH en la capas superficiales del epitelio dan origen a una débil elevación de la respuesta serológica (Coursaget, 2003). Las técnicas microscópicas, una de las cuales es de las más utilizadas, como la técnica de Papanicolaou, también tiene muchas carencias, ya que existe un rango de falsos negativos que va del 20 al 30% de las muestras analizadas por este método de tinción (Carestiato et al., 2006). Los métodos de inmunofluorescencia y las técnicas moleculares, como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) de tiempo final y en tiempo real, han sido útiles en la cuantificación de la carga viral en muestras de raspados cervicales (Moberg et al., 2003). Dentro de las técnicas moleculares, destacan los métodos directos tales como el Southern blot y la hibridación in situ o por medio de métodos de amplificación, como la captura de híbridos tipo 2 (HC2), y a través de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de punto final y en tiempo real. La PCR es una de las técnicas más utilizadas y está basada en la amplificación de una región de ADN viral (Schmitt et al., 2006), en la cual se utilizan 18 oligonucleótidos específicos (“primers”). Uno de los primers más utilizados son los denominados MY11 y MY09, que amplifican un fragmento de 450 pares de bases de la región conservada L1, éstos han sido utilizados en estudios epidemiológicos, detectando la presencia del virus en etapas tempranas e identificando al tipo de virus (Carrillo et al., 2004; Qu et al., 1997). Debido a que existen diversos genotipos virales (más de 100), es necesario utilizar técnicas complementarias para identificar a cada uno de ellos una vez identificada la presencia del virus en la muestra. Para esto existen técnicas como la hibridación, que a partir de sondas específicas puede indicar el tipo viral, según la clasificación de alto o bajo riesgo a cáncer. Sin embargo, a pesar que es un método directo, es menos sensible para identificar los genotipos virales, en comparación con otras herramientas como la técnica del Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) y de la secuenciación de nucleótidos de secuencias de ADN viral, que alcanza un 100% de especificidad (Bernard et al., 1994; Schmitt et al., 2006). III.- Justificación La investigación de la determinación y genotipificación del VPH es valiosa tanto para observar el comportamiento viral en diferentes poblaciones, como para calcular la prevalencia de los virus de alto y bajo riesgo en la región, así como los menos comunes (que se estima son alrededor del 15% del total de los virus identificados, con variaciones geográficas) (Quint et al., 2006). De esta manera, se puede contribuir en el estudio sobre la vacunación preventiva contra VPH y evaluar su eficacia, dependiendo de su distribución (Schmitt et al., 2006). En combinación con la citología ginecológica, la prueba para la detección del virus a partir de su genoma, tiene un gran potencial para mejorar en valor predictivo negativo de la prueba convencional, permitiendo disminuir los costos del programa con seguridad aceptable. Los avances en el procesamiento de la prueba de citología y automatización de pruebas que determinan ADN del virus, 19 han permitido nuevas propuestas de tamizaje, lo que incrementa cada vez más su aceptación (Cuevas et al., 2003). En México se han realizado estudios en diferentes estados, relacionados con CaCU y la presencia de VPH, pero además con factores de riesgo como por ejemplo, socioeconómicos y ginecoobstétricos (Tirado et al., 2005). Sin embargo, en Chiapas no existen estudios que arrojen datos y que permitan identificar la condición del estado con respecto a la enfermedad, así como la identificación y distribución de los genotipos presentes en la región y las posibles variedades del virus que permita contribuir en la disminución de la elevada tasa de morbilidad por CaCU que existe en el estado, por lo que es de gran valor el conocimiento a través del análisis de la asociación de diferentes factores, para poder monitorear e identificar y vigilar diferentes grupos de riesgo, así como realizar una mejor detección oportuna (al evitar la persistencia de las infecciones por VPH) y poder orientar de manera más efectiva los programas de prevención de CaCU. 20 IV.- Objetivos IV.1 Objetivo General  Identificar la asociación del Virus del Papiloma Humano (VPH) con factores sociodemográficos, ginecoobstétricos y de comportamiento reproductivo en mujeres de muy alta marginación de la Región Norte del estado de Chiapas. IV.1.1 Objetivos específicos  Estimar la prevalencia de infección por VPH en mujeres de comunidades de muy alta marginación de la Región Norte del estado de Chiapas.  Identificar los genotipos de VPH prevalentes en la región de estudio.  Analizar factores demográficos, socioeconómicos y de historia obstétrica de las mujeres estudiadas, asociados a la infección por VPH. IV.2 Preguntas de investigación  ¿Cuál es la prevalencia de infección por VPH en la Región Norte del estado de Chiapas?  ¿La ruralidad, la escolaridad, la condición étnica y el número de parejas sexuales, son factores asociados a la infección por VPH en mujeres de la Región Norte del estado de Chiapas? 21 V.- Materiales y métodos El presente estudio se realizó a partir de los datos obtenidos de mujeres de comunidades de la Región Norte del estado de Chiapas que participaron, durante el periodo marzo de 2004 a julio de 2005, dentro del proyecto “Factores que determinan la elevada mortalidad por Cáncer Cérvicouterino en los estados de Chiapas, Oaxaca y Guerrero”, que fue realizado y dirigido por el Dr. Héctor Ochoa Díaz-López de El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR) en colaboración con las instituciones: IMSS-Oportunidades, el Instituto de Salud del estado de Chiapas (ISECH) y el Laboratorio Estatal de Salud Pública en Chiapas (LESP). Este estudio se define como de tipo transversal, analíticodescriptivo. V.1 Área de estudio Este estudio se llevó a cabo en los municipios de Simojovel y Huitiupán pertenecientes a la Región Norte del estado de Chiapas (Figura 2). La selección de las comunidades de estos municipios fue a partir de poseer comunidades con alta marginación socioeconómica, por tener una ubicación geográfica de difícil acceso y por haber presencia de población indígena y no indígena (INEGI 2004). El muestreo se realizó en un total de 11 comunidades: cuatro rurales y siete urbanas, conformadas según el municipio de la siguiente manera: Del municipio de Simojovel fueron seleccionadas ocho comunidades: dos rurales (Concepción Rivera y El Jardín) y seis urbanas: la cabecera municipal y cinco comunidades consideradas como barrios: Solo Dios, San José, Liberación Social, Concepción Buenavista y Rivera Domínguez, periféricos a la cabecera municipal y con una organización independiente y con características de una zona urbana (<2 500 habitantes). Del municipio de Huitiupán fueron seleccionados tres comunidades: dos rurales (Ramos Cubilete y La Competencia) y una urbana, la cabecera municipal de dicho municipio. 22 V.2 Características de los municipios estudiados V.2.1 Municipio de Simojovel Forma parte de la Región V Norte, limita al norte con los municipios de Huitiupán, Sabanilla y Tila; al este con el municipio de Chilón; al sur con los de Pantelhó, Chalchihuitán y al oeste con los municipios de El Bosque, Jitotol y Pueblo Nuevo Solistahuacán (Figura 2). Cuenta con una población total de 31 615 habitantes, 15 738 corresponden al sexo masculino y 15 877 al femenino; la edad media es de 16 años (INEGI 2004, INEGI 2005). El 60% de la población es menor a 30 años de edad; el 59.9% de la población del municipio es indígena, de los cuales, 50.7% son monolingües, siendo el grupo Tsotsil el más predominante, aunque existen otros grupos étnicos que tienen presencia como el Tseltal y el Chol. De acuerdo a los datos publicados en el año 2000 por el Consejo Nacional de Población (CONAPO), Simojovel presentó un índice de marginación socioeconómica muy alto y un índice de analfabetismo de 44.5%. V.2.2 Municipio Huitiupán Se encuentra ubicado en la Región Norte (V), limita al Norte con el estado de Tabasco; al este con el municipio de Sabanilla; al sur con el municipio de Simojovel; al oeste con el municipio de Pueblo Nuevo Solistahuacán y al noroeste con el municipio de Amatán (Figura 2). Cuenta con una población total de 20 041 habitantes, 10 121 corresponden al sexo masculino y 9 920 son del sexo femenino, la edad media es de 16 años y el 74% de la población es menor de 30 años. El 71.7% de sus habitantes son indígenas, y de estos, 13.8% son monolingües; la etnia predominante es Tsotsil (INEGI 2004). De acuerdo con los datos publicados por la CONAPO, Huitiupán presentó un grado de marginación medio. En el año 2000, presentó un índice de analfabetismo de 37.63%. 23 V.3 Aspectos muestrales En las cuatro comunidades consideradas como rurales de los dos municipios, y en los cinco barrios considerados como comunidades urbanas ubicadas en la periferia de la cabecera municipal de Simojovel, se realizó un censo que consistió en una visita a todos los hogares de dichas comunidades con la finalidad de localizar a todas las mujeres que ya hubiesen iniciado su vida sexual y que no estuvieran embarazadas, siendo este el criterio de elección de las mujeres en el estudio. Figura 2. Mapa de los municipios de área de estudio. En las cabeceras municipales de los municipios de Simojovel y Huitiupán, consideradas como comunidades urbanas debido a que tienen una población superior a los 2500 habitantes, se realizó un muestreo sistemático con un intervalo de 1 de cada 10 hogares y con arranque aleatorio, con la finalidad de 24 localizar a las mujeres que ya hubiesen iniciado su vida sexual y que no estuvieran embarazadas en ese momento. En los casos en que en un hogar habían dos o más mujeres que cumplían con el criterio de elección, es decir que hubieran declarado haber iniciado su vida sexual y no estar embarazadas en eso momento, se consideraron a todas ellas, y si en un domicilio no había ninguna mujer elegible, se visitaba el hogar vecino inmediato. A todas las mujeres localizadas en los hogares y que cumplieron con los dos criterios de elección (haber iniciado su vida sexual y no estar embarazadas en ese momento), el personal femenino y técnicas en salud comunitaria (personal del proyecto CaCU de ECOSUR), aplicó un cuestionario estructurado (Anexo 1) denominado “cuestionario de hogares”. Este cuestionario estuvo compuesto por dos secciones: en la primera se obtuvo información demográfica, socioeconómica y de salud de toda la familia. En la segunda sección se obtuvo información sobre antecedentes ginecoobstétricos de las mujeres entrevistadas. Posterior a la aplicación del cuestionario, a las mujeres con vida sexual activa y no embarazadas se les invitó de manera verbal y por escrito, para que acudieran a la casa de salud, clínica o unidad médica rural de la comunidad para realizarse la toma de muestra para la prueba de tamizaje de detección oportuna de CaCU conocida comúnmente como Papanicolaou (Pap), así como para tomarles una muestra para detección de VPH. V.3.1 Obtención de muestras para identificación de VPH A todas las mujeres que aceptaron acudir a las casa de salud, clínica o unidad médica rural, primeramente se les tomaron sus datos para ubicarlas con el cuestionario que se les aplicó en sus hogares. Posteriormente, fueron atendidas por personal femenino del equipo de investigación de CaCU de ECOSUR, constituido por técnicas en salud comunitaria capacitadas para la toma de muestra para la prueba de Papanicolaou y para la detección de VPH, las cuales hablaban Tseltal, Tzotzil y Chol. Este personal les explicó nuevamente a cada una de las mujeres, de manera detallada, el propósito del estudio, así como los detalles para la toma de muestra. A las que aceptaron participar en el 25 estudio, les fue leída en español o en la lengua indígena que hablaran, una forma impresa de un consentimiento informado (Anexo 2) y se obtuvo su firma o huella del pulgar derecho, así como la de un testigo y un familiar presente en el momento. De las mujeres que aceptaron participar en el estudio y realizarse la prueba de Papanicolaou (Pap) se seleccionó únicamente al 25% de ellas para realizarles la prueba de detección de VPH. La selección de este 25% fue aleatoria, eligiendo una de cada cuatro mujeres que fueron llegando con arranque aleatorio, esto con la finalidad de disminuir los costos del estudio para la detección de VPH. Además de las mujeres que se eligieron dentro del 25% de manera aleatoria, también se obtuvieron muestras de manera intencionada de mujeres que en el momento de la exploración, presentaban positividad a lesiones precursoras a CaCU con la finalidad de relacionar la lesión con la presencia de VPH en la muestra. V.3.1.1 Obtención y transporte de raspados cervicales para la identificación de VPH Las muestras para la identificación de VPH consistieron en un raspado del la región endo y exocervical por medio de un cepillo cervical también conocido como citobrush, con el cual se obtuvieron células exfoliativas, haciéndolo girar en sentido de las manecillas del reloj y, simultáneamente, girando el cepillo sobre su propio eje, para obtener la mayor cantidad de células posible en toda la superficie de las cerdas del cepillo (Figura 3). Una vez obtenida la muestra, con la ayuda de unas pinzas previamente esterilizadas por medio de calor con una lámpara de alcohol, se cortó el mango del cepillo y éste se introdujo en un microtubo con 750 µl de solución de extracción (TRIS 10mM pH 8.0, EDTA 20 mM pH 8.0, SDS 0.5%), se selló el microtubo con papel paralifilm y se conservó en una hielera a una temperatura 26 de 4 ºC aproximadamente hasta su traslado al laboratorio, donde se conservó a -20 ºC hasta su procesamiento. Figura 3: Diagrama de raspado cervical para la toma de muestra para VPH V.3.2 Procesamiento de muestras en laboratorio Las muestras fueron conservadas y procesadas en el Laboratorio de Genética de El Colegio de la Frontera Sur, unidad San Cristóbal, en donde se adaptó la técnica bajo las siguientes etapas: primero se realizó una extracción de ADN, posteriormente se realizó la detección y amplificación de una fragmento del genoma viral por medio de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y, por último, se realizó la tipificación viral, utilizando la técnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés, Restriction fragment length polymorphisms), utilizando enzimas de restricción. V.3.2.1 Extracción de ADN La extracción del ADN se realizó por medio de lisis celular utilizando la técnica de Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (Anexo 3) para eliminar desechos celulares y purificar el material genómico. Esta técnica está basada en la ruptura de células con la finalidad de liberar las partículas virales de VPH y extraerles el material genómico (en el caso de que la célula estuviera infectada por el virus), obteniéndose así material genómico total compuesto por ADN humano, además de ADN de VPH en los casos en que éste se encuentre 27 infectando el tejido. Para la conservación de este material se congeló a una temperatura de -20ºC hasta su posterior utilización. Para ver la integridad del ADN obtenido se realizó una electroforesis de visualización de ADN de extracción que consistió en realizar un gel en un medio de agarosa al 1% (p/v) en solución TAE 10X (Tris base-ácido acético y EDTA), colocando en cada pocillo del gel 4 µl del ADN extraído y 3 µl de azul (mezcla de azul de bromofenol, Tris-HCl pH 8 y glicerol) como indicador del corrimiento. Las muestras se corrieron a un voltaje de 100 v en una cámara electroforética en solución TAE 10X, hasta un centímetro antes del borde del gel aproximadamente. Posteriormente, el gel se colocó en una bandeja que contenía bromuro de etidio con la finalidad de teñir el ADN; este gel se expuso a un transilumidador con emisión de luz UV, el cual hace visible el ADN una vez teñido. Se colocó a un fotodocumentador Kodak® que incluye una cámara fotográfica digital, capturando la imagen y archivándola para su posterior análisis (Figura 4). ADN extraído Figura 4. ADN extraído de células cervicales en gel de agarosa al 1%. 28 V.3.2.2 Amplificación de ADN viral por PCR Una vez extraído el ADN total, las muestras se sometieron a la técnica de PCR para detectar VPH por medio de la amplificación de un fragmento de su genoma, bajo las siguientes condiciones: Se realizó una mezcla de los reactivos necesarios para la PCR en un microtubo con capacidad de 0.2 ml agregando las siguientes cantidades: 29 µl de agua destilada estéril, 5 µl de Buffer PCR 10X (GOLD, Invitrogen®), 3 µl de desoxinucleótidos (una mezcla de los cuatro desoxinucleótidos (dATP, dTTP, dCTP y dGTP) de la marca Invitrogen® a una concentración de 2.5 mM, además 4 µl de solución de MgCl2 a una concentración de 25 mM (GOLD, Invitrogen®), se le agregó 4 µl de cada iniciador, utilizando el sistema de iniciadores (primers) específicos para VPH que delimitan un fragmento del ADN viral de 450 pares de bases (pb) de una región altamente conservada del gen L1 de VPH con las siguientes características: primer forward MY09 con la secuencia 5’-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3’ y el primer reverse MY11 con la secuencia 5’-GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG-3’ a una concentración de 10 mM y además se le agregó al microtubo 0.25 µl de Taq polimerasa (GOLD, Invitrogen®) a una concentración de 5 u/µl. Por último se le agregó 1 µl del ADN extraído de las muestras (ADN problema), obteniendo un volumen final de reacción de 50 µl. Además de las muestras de ADN pertenecientes a los raspados cervicales tomados de mujeres en el estudio, en cada lote de muestras que se procesaron, se colocó un control positivo que consistió en agregar a un tubo, bajo las mismas condiciones, 1 µl de ADN de VPH tipo 16 purificado y obtenido de cultivo de células Caski, así como un control negativo que consistió en colocar 1 µl de agua destilada en sustitución de ADN. Se incluyó también un control interno que consistió en la amplificación del gen que codifica para la proteína β-globina, usando los iniciadores o primers denominados GP20 y PC04 que amplifican un fragmento de 268 pb, el cual nos permite confirmar la integridad del ADN extraído y sometido a la PCR. La amplificación se realizó bajo las mismas condiciones de cantidad y concentración de los reactivos utilizados en la PCR de amplificación de VPH. 29 Este control se le realizó, por cuestiones de costos del proyecto, únicamente al 15% de las muestras obtenidas y en muestras con ADN escaso que, visualmente a través del gel de visualización de ADN de extracción, no contaba con una evidencia de la presencia de ADN, por lo que 50 muestras fueron analizadas aproximadamente. Los microtubos con las muestras problema y con los controles positivos con la mezcla de reactivos se colocaron a un termociclador MJ reserch® modelo PTC-100, donde se realizó la amplificación del fragmento de ADN, bajo las siguientes condiciones de tiempo y temperatura: desnaturalización inicial de 10 min. a 95ºC, posteriormente, se realizaron 40 ciclos de la siguiente manera: una desnaturalización a 95ºC por 1 min., seguido de un alineamiento de los iniciadores (primers) a 54ºC por 1 min., con una extensión de la cadena de ADN a 72ºC por 1 min., después de los ciclos, se realizo por último una extensión final a 72ºC por 10 min. Después de la amplificación, los microtubos se retiraron del termociclador y se colocaron a una temperatura de 4ºC para su posterior análisis. Para visualizar el producto y verificar la presencia o ausencia del fragmento de 450 pb de VPH, se realizó una electroforesis de visualización de producto de PCR en un gel en medio de agarosa al 1.5 % (p/v) en solución TAE 10X, donde se corrieron las muestras en una cámara de electroforesis a un voltaje de 100 v, colocando en cada pocillo del gel 5 µl del producto de PCR y 3 µl de azul como indicador. Además se adicionó en el primer pocillo del gel un patrón de referencia (ladder) de 100 pb de la marca Invitrogen®, posteriormente se dejaron correr las muestras aproximadamente un centímetro antes del borde del gel y enseguida se sometió el gel a las mismas condiciones de tinción y fotodocumentación que el gel de visualización de ADN de extracción. Para el análisis de la imagen obtenida, se procedió a la comparación de la banda obtenida a la altura de las 450 pb, según el patrón de referencia o ladder de 100 pb, esperando una banda similar en las muestras positivas a VPH y en las muestras sometidas al control interno con β-globina, esperando una banda de 268 pb (Figura 5). 30 1 2 3 4 5 C(+) C(-) Figura 5.Gel de agarosa al 1.5%. Muestras de VPH. Carril 1: ladder 100 pb. Carril 2: muestra positiva de VPH (450 pb). Carril 3: muestra positiva a β-globina. Carril 4: control positivo (VPH + β-globina). Carril 5: control negativo. V.3.2.3 Genotipificación de VPH por RFLPs Las muestras que resultaron positivas en la amplificación por PCR se sometieron a la técnica de RFLP, que consiste en que una enzima de restricción ubica una región específica del fragmento ADN y lo secciona en fragmentos, dependiendo del número de regiones encontradas por la enzima en la secuencia de cada genotipo viral, obteniendo patrones específicos para cada tipo viral. Para la utilización de esta técnica en la tipificación de VPH se sometió el producto de PCR a una digestión con siete enzimas de restricción: Bam HI, Dde I, Hae III, Hinf I, Pst I, Rsa I y Sau 3AI; bajo las siguientes condiciones: se rotularon siete microtubos con capacidad de 0.5 ml con el nombre de cada enzima, a cada tubo se le añadió 2 µl de Buffer 10X (correspondiente a cada enzima), 10.7 µl de agua destilada estéril, 1 µl de RNAsa con una concentración de 10 mg/ml, 0.3 µl de cada enzima en su respectivo tubo rotulado y a cada tubo se le añadió 6 µl ADN producto de la amplificación por PCR. Los microtubos se incubaron a baño maría metabólico a 37ºC durante dos horas. Después de la digestión, se realizó una electroforesis para observar los fragmentos obtenidos después de la acción de las enzimas de restricción sobre 31 el ADN viral, para esto se hizo en un gel de acrilamida al 30% en solución de TBE (Tris-base, ácido bórico y EDTA) y se corrieron las muestras en una cámara de electroforesis vertical, colocando en cada pocillo de cada carril del gel 10 µl del producto de la digestión de las enzimas y 3 µl de azul como indicador. Se corrieron las muestras a un voltaje de 90v, hasta que éstas llegaron aproximadamente un centímetro antes del borde del gel, posteriormente, este gel se tiñó con bromuro de etidio y se colocó al transiluminador de luz UV y se fotodocumentó. La imagen obtenida se analizó con la ayuda del software que incluye el fotodocumentador Kodak®, en donde se calcularon los pares de bases de cada banda obtenida en los carriles que contenían cada enzima, obteniendo así un patrón de bandas por cada enzima y por cada gel representativo de un tipo viral (Figura 6). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura 6.- Corrimiento de productos de la digestión por enzimas de restricción por la técnica de RFLP del producto de PCR, en gel de acrilamida al 30%. Carril 2: Bam HI. Carril 3: Dde I. Carril 4: Hae III. Carril 5: Hinf I. Carril 6: Pst I. Carril 7: Rsa I. Carril 8: Sau 3AI. Carriles 1 y 9: ladder 100 pb. 32 V.4 Análisis de datos V.4.1 Variables incluidas Para fines de análisis del presente estudio, de los datos que se obtuvieron del cuestionario de “hogares” (Anexo 1) aplicado a las mujeres en los hogares en el momento de la visita, se tomaron las siguientes variables sociodemográficas y ginecoobstétricas (Cuadro 1): Cuadro 1. Descripción de variables en el estudio. Variable Descripción Resultado de la prueba de PCR para la Positividad a VPH identificación de VPH a partir de los raspados cervicales.  sociodemográficas Edad Edad de la mujer en años Escolaridad Número en años de algún grado escolar a partir de la primaria. Dominio del castellano Mujeres que hablan y entienden, no hablan y ni entienden y entienden pero no hablan el castellano Mujeres mayores de 15 años que no saben leer ni escribir un recado. Características de la organización de la zona, considerándose urbana a la Estrato de la comunidad que sea cabecera municipal o localidad aledaña a ella con más de 2500 habitantes. Se consideraron indígenas a las mujeres Condición étnica que hablan alguna lengua indígena o se adscribe a alguna etnia. Beneficio a Mujeres que están inscritas y gozan de los Oportunidades beneficios del programa Oportunidades  Ginecoobstétricas Uso de algún método de planificación Uso de PF familiar Número de Número de embarazos que haya tenido. embarazos Número de partos que haya tenido la Número de partos mujer. Analfabetismo Número de parejas sexuales Edad de inicio de vida sexual Número de parejas sexuales que haya tenido. Edad en años en que comenzaron su vida sexual Categorías  Positivo  Negativo  Menores de 25 años  De 25 años y más.  Con algún grado de escolaridad  Sin escolaridad  Entienden y hablan castellano (incluyen las que entienden pero no hablan)  No entienden y no hablan castellano  Analfabetas  No analfabetas  Urbana  Rural  Indígena  No indígena  Con Oportunidades  Sin Oportunidades Usan PF No usan PF <3 embarazos ≥3 embarazos < 3 partos ≥ 3 partos Con una pareja sexual Con más de una pareja sexual  < 21 años  ≥ 21 años         33 V.4.2 Análisis de las variables A partir de las categorías realizadas de las variables sociodemográficas y ginecoobstétricas (factores), se calcularon las frecuencias expresadas en porcentajes, éstos se compararon con la variable positividad a VPH, siendo esta la variable dependiente. Para evaluar la asociación entre los factores de riesgo entre las variables sociodemográficas y ginecoobstétricas y la positividad a VPH, se realizó un análisis con un enfoque de un estudio de “casos y controles”, considerándose como “caso” a las mujeres con resultado positivo (VPH positivo) de la prueba de detección de VPH por PCR, y como controles a las mujeres que resultaron con la detección negativa por medio de PCR (VPH negativo), de las muestras tomadas de las mujeres que acudieron a la clínica o casa de salud durante el mismo periodo de muestreo. V.4.3 Asociación de variables Para cuantificar el grado de asociación entre las distintas variables analizadas y la positividad a VPH, e identificar los factores de riesgo, se calcularon de manera cruda las Odds Ratio (OR), también conocidas como razón de productos cruzados, razón de disparidad, razón de predominio, proporción de desigualdades, razón de oposiciones, oposición de probabilidades contrarias, cociente de probabilidades relativas u oportunidad relativa (Giesecke 1994; Dwyer et al., 1996; Guerrero 1996; Hernández et al., 2000; Lazcano et al., 2001). Estos análisis se realizaron con la ayuda del paquete estadístico SPSS versión 11.0 para Windows. 34 V.4.3.1 Creación de un Modelo estadístico de Regresión Logística Con la finalidad de explicar la variable de respuesta (positividad a VPH por PCR) evaluando la influencia de los factores que caracterizan la positividad o negatividad de dicha variable, se construyó un modelo estadístico, considerando la característica dicotómica de la variable y, no habiendo restricciones para su utilización con respecto a las demás variables en el estudio, el estadístico seleccionado fue la Regresión Logística Binomial o Binaria (Giesecke 1994; Dwyer et al., 1996; Guerrero 1996; Hernández et al., 2000; Lazcano et al., 2001). Para la construcción del modelo de regresión logística binaria, se utilizó el algoritmo no condicional con la finalidad de evaluar en el modelo las variables estadísticamente significativas y variables importantes en el estudio, aunque éstas no fueran estadísticamente significativas. Durante la creación del modelo se utilizó un criterio de exclusión para las variables independientes o explicativas (factores), el cual consistió en ir excluyendo del modelo a la variable cuando en el proceso de construcción, su valor de p fuera mayor a 0.40, finalmente se consideraron las siguientes variables: - Positividad a VPH por medio de la prueba PCR: positivo/negativo - Estrato de localidad: rural/ urbano - Escolaridad: Sin escolaridad /con algún grado de escolaridad - Número de parejas sexuales: Más de una pareja/con una pareja Para evaluar el ajuste del modelo, se utilizó la prueba de X2 de Hosmer y Lemeshow, de acuerdo a ésta prueba, se obtuvo un valor de X2=4.70 y p=0.3197, lo cual sostiene que el modelo cuenta con un ajuste aceptable. Para dichos análisis se utilizó el paquete estadístico Stata/SE versión 9.1 para Windows (Giesecke 1994; Dwyer et al., 1996; Guerrero 1996; Hernández et al., 2000; Lazcano et al., 2001). 35 VI.- Resultados VI.1 Población de estudio Se visitaron 1050 hogares de todas las comunidades seleccionadas en este estudio pertenecientes a los municipios de Huitiupán y Simojovel. Se invitó a un total de 1165 mujeres bajo el criterio de selección descrito en la parte de métodos. De las mujeres invitadas, acudieron 725 (62%) a la clínica, casa de salud o unidad médica rural para la toma de muestra de Papanicolaou (Pap). A partir de estas mujeres invitadas, se tomó una muestra sistemática, que consistió en elegir a una de cada cuatro, conforme fueron acudiendo al lugar de la toma de muestra con arranque aleatorio, con la finalidad de realizarles un raspado cervical para la identificación del VPH por medio de PCR. A través de este muestreo se tomaron 190 muestras (26%) de las mujeres que acudieron y dentro del muestreo planteado. Además de estas mujeres seleccionadas por medio de dicho muestreo, de manera adicional se tomaron 34 muestras de mujeres que llegaron de manera voluntaria, es decir, sin haber sido invitadas a participar en el estudio por el personal del proyecto. Con lo anterior, se tomaron y analizaron 224 muestras para diagnosticar VPH en igual número de mujeres. Sin embargo, estos dos grupos de mujeres (invitadas y no invitadas) se analizaron en forma separada. VI.1.1 Características generales de mujeres que se les tomaron muestra para VPH Para fines del análisis estadístico, se tomaron en cuenta las 190 mujeres que llegaron por medio de la invitación y que cumplieron con el esquema de muestreo, ya que son representativas de la población en estudio y cuentan con 36 la información sobre las características socioeconómicas y ginecoobstétricas que se plantearon en la metodología. VI.1.1.1 Características sociodemográficas Las 190 mujeres tienen un promedio de edad de 36.4 años (Figura 7) y un promedio de 3.2 años de escolaridad. Más de la mitad de ellas viven en comunidades rurales (58.4%), el resto en comunidades consideradas como urbanas (>2,500 habitantes). El 16.3% de ellas son indígenas y el 83.7% no lo son, además el 32.6% son analfabetas. La mayoría de las mujeres que acudieron (92.1%) entienden y hablan el castellano y únicamente el 7.9% de ellas no lo entienden, ni lo hablan. Además un 78.4% de ellas son beneficiarias del programa Oportunidades, el resto (21.6%) no tiene beneficios de este programa. 10 9 8 7 5 4 3 2 1 78 69 65 61 59 56 54 52 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 0 16 Frecuencia 6 Edad de la mujer en años Figura 7: Distribución general de la edad de la mujer en años. 37 VI.1.1.2 Características ginecoobstétricas Las 190 mujeres dentro del estudio, reportaron un inicio de vida sexual de 17.4 años en promedio. Sin embargo, la edad más frecuente en la que iniciaron su vida sexual fue a los 15 años (Figura 8). Ellas habían tenido 4.7 partos en promedio, el 72% más de tres partos y el resto (28%) tres o menos partos. En promedio tuvieron 4.9 embarazos, el 73% más de tres embarazos y el resto (27%), tres o menos embarazos. En promedio, tuvieron 1.12 parejas sexuales, la mayoría (93.7%) solo habían tenido una pareja sexual en su vida y el 5.8% refirió haber tenido dos parejas sexuales y solo una mujer (0.5%) declaró que tuvo más de dos parejas. 40 35 30 Frecuencia 25 20 15 10 5 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 30 No sabe Edad de inicio de vida sexual en años Figura 8. Distribución de la edad de inicio de vida sexual en años. 38 VI.2 Procesamiento de las muestras Las muestras se recibieron en el laboratorio a una temperatura de 4ºC, siendo exitosa la cadena fría para la preservación y transporte de las muestras tomadas, éstas se introdujeron a un congelador a -20ºC para conservar la muestra hasta su procesamiento pudiendo preservarse de manera satisfactoria el ADN. Se adaptó la técnica de PCR para la identificación de VPH en el laboratorio de Genética de ECOSUR, estandarizando las condiciones ideales de concentración de reactivos y de temperaturas de amplificación con los parámetros de los controles positivos de VPH tipo 6 purificado y extraído de cultivo de células Caski, obteniendo resultados confiables para el procesamiento de las muestras, comprobándolo al obtener una banda de 450 pares de bases (pb), además de confirmar la presencia de ADN humano y relacionarlo con la satisfactoria obtención de celular cervicales, a través de la amplificación del gen que codifica para la proteína β-globina, observando en el caso de amplificar, una banda de 234 (pb). VI.3 Prevalencia y positividad de VPH De las 190 muestras tomadas se obtuvieron 29 muestras positivas, estimándose así una prevalencia de VPH del 15.2% (IC95%= 10.47-21.18) en las comunidades en muestra de la Región Norte de Chiapas. Por su parte, en las 34 muestras tomadas de manera intencional, es decir, no aleatoria, cuatro (11.7%) fueron positivas. VI.3.1 Genotipos encontrados De las 29 muestras positivas que se sometieron a la técnica de RFLP, en siete (24%) no se pudo establecer el genotipo por haber tenido ADN insuficiente. Las 22 muestras en que se identificó el genotipo, se encontró que 39 los de mayor frecuencia fueron: en un 13.6% el genotipo viral 31, seguido por los genotipos 44, 52, 62, 69 con el 9.1% cada uno de ellos (Cuadro 2). Cuadro 2. Genotipos identificados y clasificación según riesgo. A=alto riesgo. B=bajo riesgo. NC= No clasificado. VI.3.1.1 Genotipo de VPH Frecuencia Porcentaje Riesgo a CaCU 11 16 32 33 39 44 45 52 54 55 57 61 62 64 69 31 Total 1 1 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 2 1 2 3 22 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 9.1 4.5 9.1 4.5 4.5 4.5 4.5 9.1 4.5 9.1 13.6 100 B A B A A B A A B B B B A NC A A - Clasificación de los genotipos La clasificación que a continuación se presenta, está de acuerdo con la asociación que tienen ciertos genotipos virales como causa necesaria con el desarrollo del CaCU, tomando como referencia la clasificación filogenética y epidemiológica que menciona la literatura. La mayoría de los genotipos encontrados en las 22 muestras genotipificadas, son de “alto riesgo” a desarrollar CaCU (59%), mientras que el 36% fue identificado como de “bajo riesgo” a CaCU, solamente el genotipo 64 (equivalente al 5% de las muestras) (Figura 9), no se encuentra relacionado con ninguna de las categorías, por lo que se le denominó como “no clasificado”, debido a que en la literatura no se reporta asociación con el riesgo a CaCU, ya que es poco frecuente. 40 NO CLASIFICADO 5% BAJO RIESGO 36% ALTO RIESGO 59% Figura 9. Distribución de genotipos encontrados según el riesgo a cáncer . VI.4 Análisis de muestras de mujeres que llegaron de manera voluntaria De las 34 muestras que se tomaron de mujeres que llegaron de manera voluntaria a la clínica, casa o centro de salud, cuatro fueron positivas a VPH (11.7%). Estas muestras positivas se tipificaron por RFLP y de las cuales dos pertenecen al genotipo 16, una del 58 y una del 31, genotipos clasificados como de alto riesgo a desarrollar CaCU. VI.5 Factores asociados a VPH Para el análisis de los casos (mujeres con VPH positivas) y los controles (mujeres con VPH negativas) con respecto a las variables sociodemográficas y ginecoobstétricas, se emplearon cuadros tetracóricos para realizar la estimación de la asociación de las variables por medio de OR’s crudas, obteniéndose los siguientes resultados: 41 VI.5.1 Factores sociodemográficos Dentro de la variable edad, el 13.2% de las mujeres con 25 años y más resultaron ser positivas a VPH, mientras que en las mujeres menores a los 25 años, el 25.8% fue positiva a VPH (Cuadro 3). La proporción de mujeres positivas a VPH, menores a 25 años, fue casi el doble (1.95 veces mayor) respecto a las mayores a esa edad. Además, la asociación entre la infección por VPH y la edad de las mujeres se analizó estadísticamente, obteniendo una OR cruda de 2.28 (IC95%=0.905-5.77). Sin embargo, el intervalo de confianza al 95% de la OR, incluye la unidad, por lo tanto, no se puede rechazar la hipótesis de que no hay diferencias (asociación) entre ambas variables. En la variable sobre el dominio del castellano, el 16.6 % de las mujeres que entienden y hablan castellano fueron positivas a VPH, mientras que dentro de la categoría no entienden y no hablan castellano, no hubo mujeres que presentaran el virus, es decir, todas las mujeres resultaron negativas a la prueba de PCR (Cuadro 3). Con base en los resultados obtenidos, se puede observar una tendencia mayor en mujeres con el dominio del castellano, sin embargo no pudo ser posible el cálculo de la OR cruda, debido a que no hubo ningún caso positivo entre las mujeres que no entienden y no hablan español, por lo que el numerador en la cociente para cálculo de la OR es cero, por lo tanto el resultado fue también cero. En cuanto a la variable analfabetismo, se observó que la proporción de positividad a VPH entre las mujeres que saben leer y escribir (18.8%) fue 2.3 veces mayor que la de las mujeres analfabetas (8%) (Cuadro 2). Sin embargo, no hubo una asociación entre estas variables. (ORcruda=2.6; IC95%=0.89-8.35). Más de la mitad de las mujeres que acudieron a la toma de muestra pertenecían a una comunidad rural (59%) y de éstas, el 21% fueron positivas a VPH, en contraste con las mujeres pertenecientes a una comunidad urbana donde únicamente el 6% de ellas fueron positivas al virus (Cuadro 3). Se observó además, una asociación de casi cuatro veces mayor riesgo de adquirir una infección por el VPH en las mujeres de estrato rural, con respecto a las que viven en un estrato urbano (ORcruda= 4.083; IC95%= 1.484-11.23). 42 En lo que se refiere a la escolaridad, el 20% de las mujeres con algún grado escolar fueron positivas a VPH, en tanto que entre las que no tenían ningún grado escolar, únicamente el 8% fueron positivas. Las mujeres con algún grado de escolaridad presentaron 2.8 veces mayor riesgo de infección por VPH con respecto a las de ningún grado escolar (ORcruda=2.88; IC95%=1.048.37). La proporción de mujeres con VPH positivo según la condición étnica fue similar entre las que pertenecían a una comunidad indígena2 y las que no, con un 16 y 15% respectivamente, no existiendo asociación aparente entre estas categorías con respecto a adquirir una infección por VPH (ORcruda=1.08 IC95%=0.37-3.09) (Cuadro 3). De igual manera, dentro de la variable que se refiere al beneficio del programa Oportunidades, las que mencionaron no tener este beneficio, tuvieron una positividad a VPH muy parecida (17%) con respecto a las mujeres que son beneficiarias por este programa (14.8%). Sin existir asociación entre la variable y la positividad a VPH (ORcruda=1.19; IC95%=0.42-3.25). VI.5.2 Factores ginecoobstétricos Tal y como puede verse en el Cuadro 4, dentro de las variables ginecoobstétricas (edad de inicio de vida sexual, utilización de algún método de planificación familiar, número de parejas, número de embarazo y número de partos) incluidas en este estudio, se analizaron en cuanto a su positividad a VPH las siguientes: En lo que se refiere a utilización de algún método de planificación familiar, se encontró una mayor positividad a VPH (19.2%) entre las mujeres que utilizan, respecto a las que no utilizan (12.5%) (ORcruda=1.66; IC95%=0.753.68). 2 Comunidad indígena se le consideró a aquellas que hablan alguna lengua indígena o se adscribe a alguna etnia. 43 De igual manera la proporción de mujeres con menos de tres embarazos fue mayor (19.6%), que la de las mujeres con más de tres embarazos (13.7%) (ORcruda=1.54; IC95%=0.66-3.58). En lo que hace al número de parejas sexuales, las mujeres que mencionaron haber tenido más de una pareja sexual, mostraron un porcentaje mayor (25%) de positividad a VPH, que las que tuvieron una sola pareja (14.6%) (ORcruda=1.94; IC95%=0.49-7.67). En lo que se refiere al número de partos la proporción de mujeres con menos de tres partos (18.9%) fue mayor respecto a las mujeres que refirieron haber tenido tres y más partos (13.9%) (ORcruda=1.44; IC95%=0.62-3.35). En relación a la edad de inicio de vida sexual, las mujeres que mencionaron haber iniciado antes de los 20 años, mostraron un porcentaje mayor (16%) de positividad que las mujeres que iniciaron su vida sexual después de ésta edad (10.0%) (ORcruda=1.71; IC95%=0.37-7.80). VI.6 Ajuste de ORs por un modelo de Regresión Logística En lo que se refiere a las mujeres que viven en una comunidad rural, se observó que la asociación que presentó respecto a adquirir una infección por VPH (ORcruda= 4.083; IC95%=1.48-11.23), se mantuvo después del control de confusores por Regresión Logística (ORajustada= 4.63; p= 0.004; IC95%=1.6113.28), observándose un riesgo de 4.6 veces mayor en las mujeres de comunidades rurales, respecto a las que viven en urbanas. Con lo que respecta a la variable escolaridad, la categoría con algún grado de escolaridad, permaneció con el valor de la OR cruda (ORcruda=2.88; IC95%=1.04-8.37) después del ajuste, siendo esté, de casi tres veces mayor de riesgo con respecto a las mujeres sin algún grado escolar (ORajustada=2.91; IC95%=1.24-9.37). 44 Cuadro 3. Variables sociodemográficas. Variable (categorías) Positivo (%) VPH Negativo (%) n OR cruda IC 95 % Edad en años ≥ 25 <25 * 13.2 25.8 86.8 74.2 159 31 2.286 0.905-5.772 Dominio del Castellano Entienden y hablan * No entienden y no hablan 16.6 0 83.4 100 175 15 0ψ 0ψ Analfabetismo No analfabetas* Analfabetas 18.8 8.1 81.3 91.9 128 62 2.63 0.89-8.35 Estrato por localidad Urbano Rural* 6.3 21.6 93.7 78.4 79 111 4.083 1.484-11.23 Comunidad indígena Si* No 16.1 15.1 83.9 84.9 31 159 1.082 0.378-3.094 85.2 82.9 149 41 1.19 0.42-3.25 Beneficio del Programa Oportunidades Si* 14.8 No 17.1 Escolaridad Con algún grado 20.0 80.0 115 2.88 1.04-8.37 Sin escolaridad* 8.0 92.0 75 *=variable de referencia. ψ= No fue posible el cálculo de la OR debido a que en una de las celdas el valor es 0. Cuadro 4. Variables ginecoobstétricas. Variable (categorías) VPH Positivo Negativo (%) (%) n OR cruda IC 95 % Utilización de métodos de PF Si* No 19.2 12.5 80.8 87.5 78 112 1.667 0.753-3.688 Número de embarazos ≥3 <3 * 13.7 19.6 86.3 80.4 139 51 1.540 0.662-3.582 Número de parejas sexuales 1 >1* 14.6 25.0 85.4 75.0 178 12 1.949 0.495-7.679 Número de partos ≥3 <3* 13.9 18.9 86.1 81.1 137 53 1.444 0.623-3.351 10.0 16.0 90.0 84.0 20 169 1.711 0.375-7.806 Edad de IVS ≥21 11-20* *=variable de referencia 45 VII.-Discusión VII.1 Comparación de la prevalencia de VPH con la reportada en otros estudios. En el presente estudio se obtuvo una prevalencia de VPH del 15.2% en las mujeres estudiadas. Esta prevalencia coincide con la reportada en los estudios efectuados en Morelos, México, los cuales reportan una prevalencia de 14 a 15% (Sánchez et al., 2002). Sin embargo, la prevalencia observada en este estudio, es muy alta en comparación con lo reportado en otros estados, tal como es el caso del estado de Durango, en donde Sánchez et al. (2006) reportan una prevalencia de 4.8%. En comparación con otros países latinoamericanos, la prevalencia observada en este estudio, puede considerarse como baja. Por ejemplo, en un estudio realizado en comunidades rurales de Guanacaste, Costa Rica, se reportó una prevalencia de 26% (Herrero et al., 2005); en Brasil fue superior al 17% (Longatto et al., 2006); y, en Argentina fue de 41% (Sijvarger et al., 2006). Sin embargo, en Chile, la prevalencia reportada es de 14% (Ferreccio et al., 2005), mientras que, en Estados Unidos de América, se reportan prevalencias superiores a 20% (Weinstock et al., 2004). En países europeos, la prevalencia es también más elevada que en este estudio, como en Dinamarca, donde reportan una prevalencia de 35%, pero con tasas de mortalidad por CaCU más bajas (12.6 por 100,000) (Svare et al., 1998). Sin embargo, en países como Italia la prevalencia es similar (15.9%) (Centurión et al., 2005) a la encontrada en este estudio y, en la India, donde es más baja, con prevalencias que oscilan entre el 9 y 12% (Laikangbam et al., 2007). 46 VII.2 Genotipos identificados Los genotipos de VPH identificados en este estudio, coinciden con los reportados en la literatura de México y en Latinoamérica. Sin embargo, sólo se presentó un caso de VPH tipo 16, que según los resultados de otros estudios (Piña et al., 2006) generalmente se encuentra en un 50% de muestras analizadas, a diferencia de Europa y de Asia, en donde se observa en menor proporción dicho genotipo, siendo el 18 el de mayor prevalencia en estos continentes (Piña et al., 2006; Lewis, 2004). Con respecto al riesgo a desarrollar CaCU, en este estudio se observó que la mayoría (59%) de los tipos identificados (11,16,31,33,39,45,52,62 y 69) son de alto riesgo, lo cual es consistente con reportes que señalan proporciones superiores al 50% de las muestras analizadas en México (Piña et al., 2006). El 24% de las muestras positivas no pudieron ser tipificadas en este estudio, debido a que al ser amplificadas por la técnica de PCR, dieron como resultado bandas tenues, que al ser tipificadas por la técnica de RFLP, mostraban una disminución significativa en la intensidad, por lo que no fue posible la determinación de un patrón necesario para la identificación del tipo viral. Esto pudo ser a causa de: 1) inhibidores presentes en la muestra como polisacáridos presentes en el tejido mucoso, o por contaminación por inhibidores durante el proceso de extracción que fueron acarreados al procesar las muestras por PCR, además que en dicho proceso de extracción es posible la degradación del material genético viral, lo que repercute en la concentración final del número de copias de ADN producto de PCR. (Carrillo et al., 2004; Evans et al., 2005; De Roda et al., 1995). 2) Existen, además, variabilidad en algunos tipos virales en la región de las secuencias de ensamble del primer. Se ha reportado que puede existir una variación en la secuencia del genoma de VPH a pesar de que el sistema de primers MY09/11 son universales y son altamente específicos. Dicha situación, sugiere la utilización de una combinación de oligonucleótidos como el caso del sistema GP5+/GP6+, que amplifican en una región interna del fragmento de 450 pb del sistema MY11/09, dando un producto de 150 pb (Sotlar et al., 2004, 47 Gravitt et al., 2000), lo que resolvería la degradación de ADN, ya que existe una mayor probabilidad de amplificación de un fragmento más pequeño e implementarlo en conjunto con otros sistemas de primers. 3) Por último, control de calidad en el proceso de extracción de ADN, así como una adecuada toma de muestra. En el caso de este estudio, hubo una capacitación previa al inicio para realizar la toma de muestra, corroborándose por medio de la PCR, con la adecuada amplificación con el sistema de primers del gen que codifica para la β-globina humana, considerándose esto como una relación directa con la adecuada cantidad de células obtenidas en el raspado cervical. VII.3 Factores asociados a VPH La prevalencia encontrada en este estudio, en términos generales es similar a la nacional. Sin embargo, se puede considerar como alta tomando en consideración las características sociodemográficas, culturales y geográficas de la población de estudio, ya que la mayoría de los estudios realizados en México han sido desarrollados en zonas urbanas con patrones culturales distintos a la población de este estudio, ya que más de la mitad de las mujeres que acudieron a la toma de muestra (58%), en este estudio, radica en zonas rurales. En este sentido, la ruralidad fue el principal factor asociado a la infección por VPH en este estudio (cuatro veces mayor el riesgo con respecto a las urbanas). Esto podría ser reflejo del efecto de una mayor migración y la existencia de barreras al acceso a los servicios de salud, aunado al bajo nivel socioeconómico que poseen las comunidades rurales en la Región Norte de Chiapas. Algunos estudios han reportado la influencia de la ruralidad sobre la prevalencia de VPH con un factor de riesgo (Giuliano et al., 1999; Sánchez et al., 2002), debido al difícil acceso que presentan las comunidades rurales, lo que dificulta el traslado de las mujeres para su atención, situación similar en el caso de las mujeres en el presente estudio. En lo que respecta a la asociación encontrada con la escolaridad en este estudio, coinciden con estudios en los que se ha señalado que el riesgo de 48 desarrollar CaCU, es 12 veces mayor en las mujeres sin escolaridad y cuatro veces mayor en las analfabetas (Tirado et al., 2005; OMS 2006; Hernández et al., 2005; Ferreccio et al., 2005) tomando en cuenta la relación del VPH con el desarrollo a CaCU. Asimismo, van en la misma dirección a otros hallazgos obtenidos en la frontera de México con Estados Unidos de América, que indican que mujeres que tienen estudios menores a la preparatoria poseen menor positividad a VPH, siendo lo contrario en el lado de los Estados Unidos de América (Giuliano et al., 1999). Dentro de la variable que se refiere al beneficio del programa Oportunidades, no se observó como factor asociado a la infección por VPH en este estudio, a pesar de que el 78% de las mujeres a quienes se les tomó la muestra reciben este beneficio y a que dentro del programa se induce a las mujeres a que se realicen el Papanicolaou (Pap). No obstante, en algunos estudios muestran que el Pap reduce la prevalencia de infecciones por VPH (Shapiro et al., 2003), por lo que se puede decir que este programa no tiene el impacto esperado sobre la prevalencia de VPH en las comunidades de estudio. La variable condición étnica de las comunidades no fue un factor asociado a la infección por VPH en este estudio, los porcentajes de positividad a VPH fueron similares para las mujeres de comunidades indígenas como para las de comunidades urbanas, posiblemente debido a que fueron únicamente el 16% del total de mujeres que acudieron a la clínica o casa de salud (n=190). Dentro de las variables ginecoobstétricas que se analizaron en este estudio, no se observó asociación en ninguna de ellas, a pesar de que en otras investigaciones sí se han encontrado, como es el caso de la utilización de métodos anticonceptivos, en donde la literatura menciona un riesgo de dos a tres veces mayor entre quienes sí los utilizan. En el uso de los métodos hormonales no se ha identificado una asociación con la infección por VPH (Longatto et al., 2006); sin embargo, en los métodos como el dispositivo intrauterino (DIU), se asocian como factor de protección (Harper, 2003). A pesar de que algunos estudios sugieren una asociación entre el número de partos y la infección (de cuatro veces mayor en mujeres con más de tres partos) (Tirado et al., 2005; OMS 2006; Hernández et al., 2005), en este 49 estudio no se encontró asociación entre las mujeres con menos de tres partos con respecto a las mujeres con tres y más partos. Sin embargo se observa una tendencia mayor entre las mujeres con menos de tres partos opuesto a lo reportado en la literatura. En cuanto a edad de inicio de vida sexual, se ha reportado que entre menor sea la edad de inicio de la actividad sexual, mayor es el riesgo a infección. Los resultados obtenidos en este estudio son coincidentes con dichos reportes, particularmente si el inicio de vida sexual fue entre los 11 y los 20 años de edad. Otro factor de gran importancia, para los objetivos de este estudio, es el número de parejas sexuales y su posible asociación con positividad de infección a VPH. En este estudio no se encontró asociación alguna, muy probablemente debido al bajo promedio, de 1.12, de parejas sexuales de las mujeres estudiadas (de hecho únicamente 12 mujeres declararon haber tenido más de una pareja sexual, de las 190 entrevistadas). Este factor se considera como importante, ya que muchos estudios reportan la asociación entre la infección por VPH y esta variable (riesgo que va de dos a tres veces), entre mayor es el número de parejas, mayor es la probabilidad de contagio por VPH o por cualquier otro agente infeccioso (Giuliano et al., 1999; OMS 2007). Por lo tanto, considerando que los varones son los principales vectores de las infecciones por VPH, la elevada migración de los varones que presentan estas comunidades, podría explicar la alta positividad de VPH en las mujeres con una sola pareja, aunque en este trabajo no se analizó la asociación con alguna variable referente a la migración. Por otra parte, en lo que toca a limitaciones tenidas en el presente estudio, debe señalarse que una de las limitantes principales fue el tamaño de muestra en algunas categorías de estudio que limitaron la capacidad de analizar de mejor manera las asociaciones que se reportan en otros estudios. Sin embargo, se cuenta con evidencia aportada por otros estudios en el sentido de una tendencia mayor de adquirir una infección por VPH en mujeres menores a los 25 años, con algún grado escolar y pertenecientes a comunidades rurales, lo que podría estar relacionado a factores migratorios. 50 VIII.- Conclusiones  La prevalencia de VPH encontrada en mujeres de comunidades de los municipios de Huitiupán y Simojovel pertenecientes a la Región Norte del estado de Chiapas fue de 15.2%, la cual es similar a la media nacional (15%).  El 45% de los genotipos encontrados: 11, 16, 31, 33, 39, 45, 52,62 y 69, pertenecen a la clasificación de “alto riesgo”, lo que es importante considerar en el desarrollo a CaCU.  Se observó una fuerte asociación entre la ruralidad y el riesgo de adquirir una infección por VPH, siendo ésta cuatro veces mayor entre las mujeres que viven en comunidades rurales con respecto a las que viven en las urbanas.  La tendencia observada fue que las mujeres alfabetas, hablantes de castellano y con mayor grado de escolaridad, tuvieran prevalencias mayores de infección a VPH. Siendo casi tres veces mayor el riesgo en mujeres con algún grado escolar.  Finalmente, se recomienda a los sistemas de salud: establecer los mecanismos adecuados para que haya una mayor cobertura en la captación y seguimiento de mujeres de comunidades rurales con difícil acceso, tomando en consideración que la mayor proporción de genotipos de VPH encontrados, son de alto riesgo a desarrollar CaCU; y fortalecer los sistemas de detección oportuna del CaCU en los grupos de mayor riesgo de adquirir una infección por VPH, es decir, mujeres menores a los 25 años y pertenecientes a comunidades rurales. 51 IX.- Referencias bibliográficas Argüello L.B, A.L.C. Castañeda, G.A Hernández. y D.A. Durán (2004). Virus del papiloma humano. Lo que saben estudiantes de licenciatura. Revista Médica del IMSS. 42 (4): 321.325. Balakrishnan L, R. Clauson, T. Weiland, M. Bianco y B. Milavetz (2006). 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EL COLEGIO DE LA FRONTERA SUR E C O S U R Proyecto: Análisis de los factores que determina la elevada mortalidad por CaCU CUESTIONARIO DE HOGARES Estamos trabajando en un estudio para conocer cuál es la situación de salud de las mujeres en esta comunidad. Por ello, le agradecería que nos contestara algunas preguntas que le vamos a hacer sobre las personas que viven aquí en su casa, acerca de la salud de las mujeres, de qué enferman más, si usan servicios de salud y algunas cosas relacionadas con sus casas. Todo lo que Ud. nos diga será absolutamente confidencial y se usará exclusivamente con fines estadísticos, es decir, nadie se va a enterar de lo que Ud. nos diga. No. de cuestionario IDENTIFICACION DEL HOGAR Nombre de la localidad: Barrio: Municipio: Puntos de referencia de identificación del domicilio del hogar Número de vivienda RESULTADO Y PROCESO DE LA ENTREVISTA No. de visita Primera día/mes/año Fecha Segunda día/mes/año Tercera día/mes/año Entrevistador (claves) Informante Hr. de inicio Hr. final Duración (minutos) Supervisor Resultado entrevista* Proceso entrevista** Codificador Capturista/ Crítico *Resultado entrevista: 1. 2. 3. 4. Completa Incompleta Incompleta, se hizo cita. Incompleta, negó información. 5. Negó entrevista 6. Nadie en casa 7. Informante inadecuado 8. Se hizo cita 9. Otro (especifique) © Dr. Héctor Ochoa, ECOSUR, 2004 **Proceso de la entrevista: 1. Sin supervisor, no revisada en campo 2. Sin supervisor, si revisada en campo; 3. Acompañada por supervisor 4. Opción uno con reentrevista 5. Opción dos con reentrevista 6. Otros (especifique) 1 59 CEDULA DE REGISTRO FAMILIAR No. de cuestionario N ú m e r o 1. ¿Me puede decir el nombre de todas las personas que viven en esta casa, empezando por el jefe del hogar, hasta el niño más chiquito? Si un bebé todavía no tiene nombre, regístrale como R/N (Recién Nacido) con sus apellidos d e Total de personas en la vivienda _______ p e r s o n a No de identificación de OPORTUNIDADES 1ª persona (16 dígitos) 666 = No comprobante 2ª persona (sólo en caso de que en la familia cuenten con más de un número de identificación) 2. ¿Cuál es el sexo de? 3. ¿Qué edad tiene? 4. Parentesco 5. Estado Civil (Anotar con relación al jefe 1. casado/a Registre en de familia) 2. unido/a años 1. Jefe /a de 3. Divorciacumplidos/ do/a determinados fam. por ellos. 2.Esposa(o) 4. soltero/a 3.Hijo(a) 5. Viuda/o 1.Hombre 4.Padre 6. Separado/a 2. Mujer Casos 5.Madre 7. Otro 6.Abuelo(a) especifique especiales: 7.Tío(a) 000 = 8.Nieto(a) < 1 año 9.Suegra (o) 99 = < 12 777 = NS 10.Padrastro años, no 888 = NR 11.Nuera / aplica Yerno 12.Hermano/a) 13.Otros (especificar) 6. ¿Qué lengua(s) indígena(s) habla? 7. ¿Entiende 8. ¿Hasta qué grado de la y habla usted escuela terminó? el castellano? Pregunta sólo para personas Aplica para de 6 y > años Aplica para personas de 5 00 Sin escuela personas de años o más 01 Preescolar, 1. año 5 años o 1. Entiende y 02 Preescolar, 2. año más 1.Tseltal habla 03 Preescolar, 3. Año 2.Tsotsil castellano. 1. Primaria 3.Tojolabal 2.Entiende, 2. Secundaria 4. Zoque pero no 3. Preparatoria 5. Otro habla 4. Profesional (especifique castellano 5. Bachillerato 6. Ninguno 3.No entiende 6. Otros (especificar) ni habla el - Entrevistador: anote el castellano 8 = NR número que terminó según el 9= NA (< de grado ( ej. 3. año de la primaria: 13, SOLAMENTE 5 años) 8 = NR 9 = NA (< de 2 DIGITOS). 77 = NS, 88 = NR 5 años) 99 = NA (<6 años) 1.M 2.M 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 N ú m e r o d e p e r s o n a 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 © Dr. Héctor Ochoa, ECOSUR, 2004 CEDULA DE REGISTRO FAMILIAR N ú m e r o d e p e r s o n a 9. ¿Sabe leer y escribir? 10. ¿Cuál es su trabajo principal? (ocupación principal) 1. Agricultor Aplica para personas de 6 2. Hogar 3. Estudiante y > años 4. Empleado 1. Lee y escribe 5. Hogar y agricultor 6. Estudiante y agricultor 2. Lee y escribe 7. Obrero / Artesanias un poco por ej.Carpintero/albañil 8. Comercintes/ 3. No lee ni empelados escribe 9. Empleados calificados 10. No remunerados 11. Otros (especificar) 7 = NS Pregunta sólo para 8 = NR personas de 10 y más 9 = NA años (< de 6 77 = NS años) 88 = NR 99 = NA ( < de 10 años) No. de cuestionario Área rural 11. ¿ Le ayudó a alguien en la cosecha anterior? Área rural 12. ¿Por cuántos días trabajó usted en total? Pregunta sólo Pregunta para personas de sólo para 10 y más años personas de 10 y más 1. Si años. 2. No 13. ¿Alguien de la familia hace algún otro trabajo para ganar dinero? Pregunta sólo para personas de 10 y más años. 0. Nada 1. Tienda 2. Empleado 3. Artesanía 4. Trabajo doméstico Si la respuesta es 777 = NS NO, continuar 5. Otros (especificar) Registre según se le con la pregunta 888 = NR 999 = NA (< refiera 12. de 10 años o 77 = No sabe respuesta 2 en 88 = No respuesta 7 = NS preg. 10). 8 = NR 99 = No aplica (< de 9 = NA (< de 10 10 años) años) Código Lugar del trabajo Anota en días 14.Pídele el último comprobante de pago de OPOTUNIDADES/ PROGRESA - Anote el No. de Progresa en la segunda página ( Preg. No. 1) 14.1 ¿En esta casa, alguien de la familia recibe algún apoyo de OPORTUNIDADES/ PROGRESA actualmente? 1.Si ( sigue con preg 13.2 ) 2.No ( sigue con preg 14.1 ) 14.2 Especifique que tipo de apoyo 1. Dinero para alimentación 2. Dinero para educación ( Beca) 3. Dinero para útiles escolares 4. Papilla 5. Útiles escolares (en especie) 6. Otros (especifique) 77 = NS, 88 = NR, 99 = NA, 6_ = Sin comprobante______________________ Preg. Preg. 14.2 14.1 1.M 2.M 3.M 14.3 ¿En total cuánto ($) recibió cada persona en el último bimestre? Anote la cantidad recibida en pesos 666 = No comprobante 777 = NS 888 = NR 999 = NA ( nada) Anota el Bimestre que cubre el pago: _____________ CANTIDAD TOTAL: ______________ $ Pesos ( según comprobante de pago) Cantidad 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 3 60 No. de Cuestionario CARACTERISTICAS DE LA VIVIENDA Ahora vamos a hablar sobre algunas cosas de la casa donde ustedes viven 15 ¿Cuántos cuartos tiene su casa? (Sin contar la cocina) _________ cuartos 16. ¿De qué material está hecho la mayor parte del piso de su 1. Tierra 2. Cemento o firme casa? 3. Tierra y Cemento en la misma cantidad 4. Madera, Tabla, Mosaico u otros recubrimientos 17. ¿ Con que material esta cocinando usted? 1. Leña 2. Carbón 3. Gas 18. ¿Usted tiene agua entubada dentro de la casa/ patio? 19. ¿Usted tiene luz eléctrica en la casa? 20. ¿Usted tiene TV en la casa? 21. ¿Usted tiene Refrigerador? 22. ¿Usted tiene una Letrina / WC propio para su familia? 23.Zona urbana: ¿Su casa es rentada o propia? 24. ¿Cada cuándo comen carne de res/ puerco las personas que viven aquí ? 4. Otro, especifique _:____________ ________ ________ 1.M _______ 2. M_______ 1. Si 2. No 1. Si 2. No (sigue con preg.21) 1. Si 2. No 9. NA 1. Si 2. No 9. NA 1. Letrina 2. WC (con drenaje/ agua corriente) 3. Pozo / hoyo negro 4. Nada, hacen en el monte 5. Otro, (especifique) _______________ 1. Rentada 2. Propia 3. Otro, especifique______________ 77. NS 88. NR 99.NA 1. Diario 2.Uno o dos veces a la semana 3. Una vez cada 15 días 4. Una vez cada mes 2. Cada dos meses 6. Una a dos veces al año 7. Nunca comen carne 77. NS 88. NR ________ ________ ________ ________ ________ ________ ________ MORBILIDAD EN EL ÚLTIMO MES DE TODAS LAS MUJERES MAYORES DE 12 AÑOS QUE SON UNIDAS/ CASADAS Y YA TENGAN SU REGLA EN LA FAMILIA (Vea preg. No 5) Enseguida les voy a leer una lista de enfermedades para que las mujeres en esta casa me digan si se sintieron o se han sentido mal por causa de una enfermedad o molestia en el ultimo mes (Encuestador: primero pregunta abierta, después de la respuesta de la mujer lea con voz clara y pausada una por una las enfermedades y vaya anotando en los espacios correspondientes a los que hayan o estén padeciendo tales enfermedades en los últimos tres meses), Encierre en un círculo o anote el problema o enfermedad declarada No Enfermedad Nombre y N° Nombre y N° Nombre y N° Nombre y N° 01 Náusea / vómito / ascos / mareo 02 Calentura/ fiebre/ escalofrío 03 Debilidad general/ falta de fuerza/ cansancio 04 Dolor en la matriz 05 Ardor en la vagina / en su parte 06 Comezón en la vagina/ en su parte 07 Menstruación irregular 08 Menstruación prolongada 09 Dolor al tener sexo 10 Sangrado al tener sexo 11 Dolor y sangrado al tener sexo 12 Flujo vaginal, que huele fuerte 13 Tumores, Bolas, Cáncer de la matriz 14 Dolor en el pecho/ Senos 15 Quiste en la matriz/ su parte 16 Dolor en el vientre 17 18 61 No. de Cuestionario SECCION ANTECEDENTES GINECO-OBSTETRICOS NOMBRE:_________________________ N° de la persona: ______ (a la que se hace seguimiento) Entrevista: 1. Directa 2. Indirecta (discapacitada) Marcar con un X / encierre Antecedentes gineco-obstétricos 25. ¿Hasta hoy, cuántas veces ha estado usted embarazada? __________ veces 77. NS 88. NR ________ 26. ¿ A que edad se embarazó por primera vez? ___________ años 27. ¿Cuántos hijos e hijas ha tenido que hayan nacido vivos? ( incluye también a los que hayan dado señales de vida aún cuando hubieran muerto minutos después del parto) 28. ¿Cuántos de sus hijos e hijas aun viven? 29. ¿ Cuántos de sus hijos e hijas se le han muerto 77. NS 88. NR 99. NA 1. _______ Total 1. _______ Hijos ( masculino) 2. _______ Hijas (femenino) 99 = NA 1. _______ Total 1. _______ Hijos ( masculino) 2. _______ Hijas (femenino) 99 = NA 1. _______ Total 2. _______ Hijos ( masculino) 3. _______ Hijas (femenino) 99 = NA _________ 1. ______ 2. ______ 3. ______ 1. ______ 2. ______ 3. ______ 1. ______ 2. ______ 3. ______ ___________ años _________ 30. ¿A que edad regló usted por primera vez? 31. ¿Cuál fue la fecha de la última regla? 77. NS 32. ¿Se han operado a usted para quitarla la matriz? 77. NS 88. NR Fecha: ___ (día)/ _____(mes)/_______ (año) ________ 88. NR 1. Si 2. No 7. NS 8. NR 1. Si 2. No ( sigue con la pregunta 34) ________ 33. ¿Usted está embarazada actualmente? 34. Zona Rural: ¿Con cuántos años se casó? Zona Urbana: ¿A los cuántos años tuvo su primera pareja ( primera relación sexual) ? 35. Zona Rural: ¿Cuántos maridos ha tenido usted? Zona Urbana: ¿Cuántas parejas sexuales ha tenido usted hasta ahora? 36. ¿Cuántos partos ha tenido usted en total? 7. NS 8. NR ________ _________ años 7 = NS _________ 8 = NR 9= NA 77 = NS ________ 88 = NR 99 = NA ________ _________ partos _______ 77 = NS 88 = NR 99 = NA 37. ¿Cuántos de estos partos fueron cesáreas/ por operación? _________ cesáreas 77 = NS 38. ¿Cuántos abortos ha tenido/ Cuántos niños y niñas perdió usted? (Abortos son perdidos del niño hasta la 20. Semana/ cuarto mes del embarazo) 39. ¿Hay una mujer en su familia ( madre, tía, abuela) que tiene/ tuvo una enfermedad de mujeres, como tumores, cáncer...? 88 = NR 99 = NA ________ _________ abortos/ niños- niñas perdidos 77 = NS 1.Si 7 = NS 88 = NR 2. No 99 = NA _________ 8 = NR ________ No. de Cuestionario 40. ¿Usted usa un método de planificación familiar / no tener hijos? 1.Si 2. No (sigue con la preg.43) 62 No. de Cuestionario SEGUIMIENTO DE LA ULTIMA MUESTRA 54. ¿Dónde se hizo la prueba? 55. ¿Usted recibió el resultado? 56. ¿Cuánto tiempo después de la toma de la muestra lo recibió el resultado? 57. ¿Cuál fue el resultado? 1. Unidad de salud /SSA 2. UMR IMSS 3.CASA de salud/ TAPS / COCS 4. En una campaña 5.Otro, especifique _____________________ 77. NS 88. NR 99. NA 1. Si 2. No (sigue con preg.5) 7. NS 8. NR 9.NA _________ semanas/ meses (especifique) 5. Tengo un virus 6. Tengo principios de Cáncer 7. Tengo Cáncer 8.Otro, especifique_________ 77. NS 88. NR 58. ¿Qué tratamiento/ remedio le aconsejaron? 1. Me dieron medicamentos 3. Me dieron cita ________ _________ 77. NS 88. NR 99.NA 1. Salió bien 2. Salió mal 3. Tengo una inflamación 4. Tengo infección _________ 9 9.NA _________ 2. Voy al hospital 4. Necesito un estudio más 5. Otro, especifique__________ 77. NS 88. NR __________ 99.NA 59. ¿Qué le pareció el trato que recibió cuando se hizo la prueba? 1. Muy bien 2. Bien 3. Regular 4. Mal 5. muy mal 60. ¿Por qué? 1.________________________________________ 7. NS 8. NR ________ 9.NA 2.________________________________________ 77. NS 61. ¿Cuánto tiempo hizo de su casa a ______ (lo que haya contestado como primer agente preg.54) para la muestra? 62. ¿En qué medio de transporte fue a _______ (lo que haya contestado como primer agente preg.54) 88. NR 99.NA _________ anote en minutos 777= NS __________ 999 = NA 1.A pie 2. Transporte colectivo 3.A pie y en transporte colectivo 4.En coche o vehículo propio 77. NS 88. NR 99.NA 5.Otro (especifique) _____________________ ________ _______ 63. En total ¿Cuánto se gastó por causa de hacerse la muestra ( En pesos)? 1. En consultas (con doctores, enfermeras etc.) ______ 7777 = NS 8888 = NR 2. En análisis de laboratorio ______ - Pregunte por cada opción - Si no supieran, se puede aproximar y anotar que fue una aproximación 3. En medicinas, remedios caseros, hierbas ______ 4. En pasaje de la mujer (transporte, ida y vuelta) ______ - Si la gente no diferencia entre consulta y medicamentos, anótelo como “otro” 5. En alojamiento, comida ______ 6. Gastos para el / los acompañante/s ( transporte, alojamiento, comida) ______ 7. En otras cosas (especifique) _______ 9999 = NR Entonces lo que se gastó en total fueron: $ No. de Cuestionario 63 X.2 Anexo 2. Carta de consentimiento informado. EL COLEGIO DE LA FRONTERA SUR CONSENTIMIENTO INFORMADO TITULO DEL PROYECTO: “Análisis de los factores que determinada la elevada mortalidad por cáncer cérvicouterino en los Estados de Chiapas, Guerrero y Oaxaca” OBJETIVO: El cáncer de la matriz o cáncer de la mujer es una enfermedad que puede prevenirse y puede curarse. Sin embargo, muchas mujeres en nuestro pais mueres por esta enfermedad. Con este programa de detección e investigación nosotros queremos detectar casos de mujeres con lesiones premalignas y conocer las causas por las cuales las mujeres que padecen esta enfermedad no logran sanar y mueren. PROCEDIMIENTO: Se solicita su participación para contestar un cuestionario que incluye preguntas sobre la condición de su vivienda, de la utilización que usted hace a los servicios de salud, algunas preguntas sobre lo que usted sabe del cáncer de la mujer y también algunas preguntas personales sobre su salud reproductiva, todo lo cual será absolutamente confidencial. Posteriormente, si usted puede también participar con nosotros permitiéndonos realizarle un examen que incluye la toma de muestras del cuello de la matriz para saber su usted padece de alguna enfermedad de su parte. Se tomarán todas las precauciones al tomar la muestra y todos los materiales que empleemos serán estériles (limpios). EXPLICACIÓN: Su participación es sumamente importante para este proyecto. La información que usted pueda proporcionarnos y los resultados de los exámenes (Papanicolaou, IVAA, PCR) que usted nos permita realizarle nos ayudará a proporcionarle la atención que requiera y conocer el por qué las mujeres se enferman de cáncer de la matriz y el por qué mueren por esta enfermedad. La información que obtengamos a través de su participación servirá para mejorar la atención de la salud de las mujeres de nuestro estado y del pais. CONFIDENCIALIDAD: Toda la información obtenida tanto de las muestras obtenidas como de algunas preguntas que se le harán, será totalmente confidencial, es decir, nadie se va a enterar. De ninguna manera las muestras obtenidas serán utilizadas para propósitos diferentes al proyecto aquí descrito. BENEFICIOS: Los beneficios que usted pues recibir por participar en este estudio son: a) conocer su estado actual de salud de su aparato genital; b) recibir atención y tratamiento por parte de las instituciones de salud colaborantes en el proyecto en caso de que así lo requiriera; c) recibir información de la enfermedad del cáncer de la mujer y cómo puede prevenirlo. PREGUNTAS: Usted tiene la libertad de hacer todas las preguntas que juzgue necesarias. DERECHO A REHUSAR O ABANDONAR: Su participación en este proyecto es enteramente voluntaria, por lo que es libre de rehusarse (negarse) a participar o de abandonarlo en el momento que decida. CONSENTIMIENTO: Consiento en participar en este estudio y he tenido la oportunidad de leerlo o escucharlo. PARTICIPANTE (nombre y firma) ________________________________________ TESTIGO (nombre y firma) ________________________________________ FECHA ________________________________________ FIRMA DEL INVESTIGADOR ________________________________________ Investigador responsable: Dr. Héctor Ochoa Díaz-López ECOSUR. Carretera Panamericana y Periférico Sur S/N Barrio de Ma. Auxiliadora. San Cristóbal de las Casas, Chiapas Teléfono: (967) 674 90 00, 678 4558, ext. 9102 64 X.3 Anexo 3. Técnica de extracción de ADN: Fenol-CloroformoAlcohol Isoamílico. 1. Colocar la muestra en 750 µl de solución de extracción (TRIS 10mM pH 8.0, EDTA 20 mM pH 8.0, SDS 0.5%) y congelar a -20°C hasta su procesamiento. 2. Quitar el cepillo hisopo con la ayuda de dos pinzas de disección estériles. 3. Agregar 3.8 µl de Proteinasa K (20 mg/ml), mezclar vigorosamente con el vortex por 20 seg. 4. Incubar en baño metabólico a 65°C durante 20 min. 5. Añadir 250 µl de Fenol Cloroformo-Alcohol Isoamílico, mezclar con el vortex por 45 seg. 6. Centrifugar durante 5 min. a 13000 rpm a 4°C, recuperar la fase acuosa y pasar a un tubo limpio. 7. Repetir los pasos 4 y 5 tres veces más. 8. Recuperar la fase acuosa del ultimo lavado del paso anterior y añadir 250 µl de Cloroformo Alcohol-Isoamílico (24:1), mezclar con el vortex por 45 seg. y centrifugar por 5 min a 13000 rpm. 9. Recuperar la fase acuosa poner en un tubo limpio y agregar 75 µl de LiCl 8 M, mezclar aprox. 15 seg. 10. Centrifugar a 13000 rpm, durante 5 min, recuperar el sobrenadante y colocarlo en un tubo limpio. 11. Agregar 33 µl NaCl 5 M agitar unos seg y agregar 850 µl de Isopropanol mezclar por inversión hasta que se forme la hebra de ADN. 12. Incubar toda la noche a -20°C. 13. Centrifugar a 13000 rpm durante 10 min; desechar el sobrenadante y recuperar el precipitado. 14. Lavar con 1 ml. de etanol al 70% mezclar suavemente por inversión y centrifugar un min. a 13000 rpm (se lava 3 veces). 15. Desechar el etanol y escurrir el exceso en un papel absorbente y secar el pellet. 16. Resuspender el pellet en 55 µl de agua desionizada estéril y guardar a 20°C. 65