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RESOLUCIÓN OIV/OENO 391/2010
LÍNEAS DIRECTRICES ENOLOGÍA
SOBRE
LOS
AUTOANALIZADORES
COLORIMÉTRICOS
EN
LA ASAMBLEA GENERAL Visto el artículo 2 apartado 2 iv del acuerdo del 3 de abril 2001 relativo a la creación de la Organización Internacional de la Viña y el Vino, A propuesta de la Subcomisión de Métodos de Análisis, CONSIDERANDO la resolución Oeno 10/2005 «Guía práctica para la validación, el control de calidad y la estimación de la incertidumbre de un método de análisis enológico alternativo», que permite a los laboratorios efectuar el trabajo de enlace del método interno automatizado con el método de referencia OIV. CONSIDERANDO que esta guía incluye también procedimientos de control de la calidad de los resultados obtenidos por estos métodos automatizados, que garantizan una utilización segura. CONSIDERANDO que sólo los métodos publicados en la Recopilación de los métodos internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV o en la recopilación de los métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas de origen vitivinícola de la OIV tienen un carácter oficial de referencia y son aplicables para el control y reglamento de discrepancias. DECIDE publicar independientemente las directrices relativas a los autoanalizadores colorimétricos en enología adjuntas.
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DIRECTRICES SOBRE LOS ANALIZADORES AUTOMÁTICOS EN ENOLOGÍA La primera evolución del análisis automático en enología apareció a principios de los años setenta. Se realizaron a partir de analizadores de flujo continuo, utilizados hasta entonces esencialmente en biología médica. Los principales parámetros accesibles eran entonces la acidez volátil, los azúcares reductores, el dióxido de azufre libre y total. Más tarde, se adquirieron algunas técnicas enzimáticas, autorizando, en particular, la dosificación de la glucosa y la fructosa y de los ácidos málico y láctico. En 1980, los analizadores de infrarrojo cercano (PIR) permitieron una medida rápida del grado alcoholico volumétrico en los vinos y de los azúcares en los mostos. Los primeros analizadores secuenciales, resultantes del análisis médico, aparecieron a principios de los años noventa. Permitieron rápidamente el acceso a numerosas determinaciones basadas en reacciones químicas (compuestos fenólicos totales, dióxido de azufre libre y total, de ácido tartárico, ácido acético, o enzimáticos (glucosa y fructosa, ácido málico y láctico, ácido cítrico,…) Más tarde, al final de los años noventa, la técnica a infrarrojos por transformada de Fourrier (IRTF) vino a completar los procesos automáticos a disposición de los laboratorios de enología. Todas estas técnicas automáticas están actualmente ampliamente extendidas en todo el mundo. Permitieron una disminución muy significativa del coste del análisis enológico que se tradujo en la posibilidad, no de disminuir éste para los usuarios sino de permitirles acceder, para un coste dado, a muchos más parámetros y en consecuencia a más información. Esta situación permitió acompañar mediante el análisis todas las etapas de la vida del vino de una manera mucho más eficaz. El análisis automático también rápidamente resultó fiable y repetible, a condición de aplicar técnicas de control de calidad interna (CQI)adecuadas. Una característica fundamental de todas las técnicas automáticas es que son estrictamente comparativas. Los analizadores automáticos deben, en efecto, ser objeto de calibraciones iniciales con patrones de valor conocido. Estas calibraciones pueden ser permanentes, semipermanentes, diarias o incluso estar asociadas a cada serie de muestras. La calidad de los resultados obtenidos ,depende por tanto directamente de la de los patrones de calibración aplicados. Estos patrones pueden ser vinos o mostos que presentan valores conocidos para los parámetros buscados. Pueden también ser soluciones sintéticas. Los métodos automáticos siguen siendo, generalmente, métodos internos para los cuales cada laboratorio debe poder asegurar la calidad de los resultados utilizando distintos enfoques: - validación inicial del método - calidad de los patrones de calibración y control utilizados - participación regular en cadenas de comparación entre laboratorios - comparación regular de los resultados con los obtenidos por los métodos de referencia, etc… Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general
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La amplia utilización de las técnicas automáticas en el mundo del vino vuelve su papel tecnológico, comercial y de control, innegable y fundamental para la economía y los intercambios vitivinícolas. Ello justifica la publicación de esta guía que no constituye un documento de referencia pero solamente de información. Los objetivos de este documento son solamente: - describir el principio de las técnicas aplicadas, la práctica de su aplicación y los límites de su utilización. - enumerar los métodos aplicados más corrientes, sabiendo que estos son a menudo adaptados parcialmente por los laboratorios en función del aparato utilizado o las matrices aplicadas. La lista propuesta no es, en ningún caso, restrictiva y son posible otras aplicaciones. Regularmente se proponen nuevas aplicaciones..
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DIRECTRICES SOBRE LOS AUTOANALIZADORES COLORIMÉTRICOS EN ENOLOGÍA Advertencia: Esta guía no constituye un documento de referencia sino sólo de información. Los métodos que figuran en las líneas directrices no pueden ser considerados como métodos de referencia de la misma manera que los que figuran en la Recopilación de los métodos internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV o en la recopilación de los métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas de origen vitivinícola de la OIV. Sólo los métodos publicados en la Recopilación de los métodos internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV o en la recopilación de los métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas de origen vitivinícola de la OIV tienen carácter oficial y son aplicables para el control y la solución de controversias.. Estos analizadores automatizan las diferentes etapas de un análisis químico o enzimático, y utilizan una detección colorimétrica. Existen dos grandes familias de analizadores en enología:
Los analizadores de flujo continuo; Los analizadores secuenciales.
1 LOS ANALIZADORES DE FLUJO CONTINUO Los primeros trabajos sobre la automatización del análisis químico en enología por flujo continuo fueron realizados por MORFAUX, SARRIS et al. entre 1969 y 1972. Sin embargo, hasta 1974 esta técnica no empezó a llegar a los laboratorios de enología de campo, con la puesta a punto de métodos fiables y repetibles.
1.1
Composición y principio de una cadena de análisis automático de flujo continuo
Las cadenas de análisis automático de flujo continuo se componen de módulos independientes, cada uno de los cuales cumple una función especifica (figura 1).
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1.2 El distribuidor de muestra Está formado por una bandeja que puede contener de 20 a 60 vasos de muestra de un volumen de entre 1 y 3 ml. Un brazo pivotante provisto de una aguja toma las muestras unas tras otra . Entre cada muestra, la aguja se sumerge en un líquido de lavado. La aguja está unida al resto del circuito analítico por un tubo de PVC. Así se aspira por la aguja hacia el circuito analítico el líquido de lavado, una muestra, de nuevo el líquido de lavado y una nueva muestra, etc.. La cadencia del análisis se regula a nivel del distribuidor de muestra. Si la aguja toma una muestra durante un minuto y se sumerge en el líquido de lavado durante otro minuto, la cadencia será de 30 muestras por hora. Es posible ajustar a voluntad esta cadencia, así como la relación del tiempo de lavado y el tiempo de toma de la muestra, que no tiene por qué ser de 1 como en el ejemplo anterior, sino de 2, 1/2, 1/3, 1/4, etc.
1.3 La bomba peristáltica Es el corazón de la cadena de análisis automático. La bomba regula todos los movimientos del líquido en el circuito analítico. Suele estar formada por entre 20 y 30 canales. Cada uno de ellos está formado por un tubo, generalmente de PVC, presionado contra un soporte por una serie de rodillos. El avance de estos rodillos hace circular el líquido dentro del tubo de bomba. El caudal de cada uno de los tubos depende de su diámetro interior. Así, utilizando tubos de diámetros diferentes (de 0,005 a 0,110 cm) y aun manteniendo la velocidad de avance de los rodillos de la bomba rigurosamente constante, puede crearse una gama muy amplia de caudales. Esto permite regular de forma precisa los caudales de admisión de la muestra y de los diferentes reactivos en el circuito analítico.
1.4 Un casete analítico Incluye todos los elementos del circuito analítico. En él, la muestra puede someterse a diferentes tratamientos en función del análisis a realizar: dilución; diálisis; adición de reactivo; mezcla; destilación; Transferencia al baño de agua termostático (temperatura y duración variables). Una parte del circuito puede termorregularse. Al salir de la bomba, las burbujas de aire segmentan todos los flujos líquidos que circulan por el circuito analítico cada 1 ó 2 centímetros. Estas burbujas de aire, gracias a las fuerzas de tensión superficial, impiden la difusión de un compuesto en solución de una sección de columna líquida tomada entre dos burbujas hacia la que le precede o le sigue. Además, la burbuja de aire seca la pared del tubo de vidrio o PVC por el que circula. De este modo, es imposible la contaminación de una muestra a otra, así como la dilución de una muestra por el líquido de lavado que le precede y le sigue. Este principio fundamental de la separación de los líquidos por una burbuja de aire se utiliza empezando desde el del distribuidor de muestra. A nivel de la aguja de mustreo , la aspiración es constante; cuando la aguja pasa del baño de lavado a la cubeta de muestra, se toma una pequeña cantidad de aire, que crea una burbuja que, en el tubo de toma, separa el líquido de lavado de la muestra.
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Existe una segunda generación de material de flujo continuo, que utiliza la técnica del microflujo, que permite evitar la segmentación. Este tipo de material, debido a problemas de obstrucción difíciles de resolver, goza de poca difusión. Los principios analíticos siguen siendo los mismos que para los equipos de segmentación.
1.5 Un detector La detección más habitual se hace por colorimetría. La mayoría de los análisis químicos automatizados se basan en un método colorimétrico, en particular en el ámbito enológico. Sin embargo, pueden utilizarse otros detectores: -
espectrofotómetro UV; fotómetro de llama; fluoroscímetro; nefelómetro; contador de células; refractómetro; electrodos específicos;
1.6 Un registrador La presencia del compuesto buscado en la muestra tomada se traduce, en el detector, por una señal cuya la intensidad es proporcional a la concentración de dicho compuesto. Esta señal se registra en forma de picos (fig. 2). Entre cada pico, el retorno hacia la línea de base corresponde a la extracción del líquido de lavado. La fiabilidad del método de análisis de flujo continuo depende de la lectura del registrador, según los principios siguientes: 1° La creación de un estado de equilibrio en el circuito analítico tal que el retorno a la línea de base se obtiene siempre que se extraiga líquido de lavado y por el hecho que una concentración determinada en la muestra del compuesto analizado dé un pico de una altura constante. 2° El método de dosificación es un método comparativo. Todas las mediciones se realizan respecto a una gama patrón cuyas concentraciones son perfectamente conocidas. Cualquier disfunción del circuito se traduce en una perturbación del registro (desviación de la línea de base, variación de la forma de los picos, variación de la altura de los picos de calibrado, etc.), lo que limita los errores de análisis.
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Fig. 2 Modelo de registro obtenido en el caso de la dosificación de la acidez volátil en los vinos para una cadencia de 30 muestras por hora. (los valores indicados se expresan en g/l de ácido sulfúrico)
1.7 Una interfase digital Permite convertir la señal analógica procedente del colorímetro en un valor numérico que puede expresarse directamente en concentración del compuesto dosificado. Generalmente incluye un sistema de control que permite garantizar que la dosificación no se ha visto perturbada.
2
LOS ANALIZADORES SECUENCIALES
2.1 Principio y organización de un analizador secuencial Estos analizadores son casi siempre multiparamétricos. Así, pueden realizar varias dosificaciones sobre una misma muestra y dichas dosificaciones pueden programarse para cada muestra. Cada muestra a analizar se toma y se coloca en una cubeta de medición transparente, donde recibe el o los reactivo(s). Se realiza una medición colorimétrica directamente en esa cubeta. Las cadencias están comprendidas entre 50 y 1.000 dosificaciones por hora. Las principales aplicaciones se efectúan en el ámbito del análisis químico o del análisis enzimático.
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Los volúmenes de reactivo necesarios son bajos, lo que limita los costes, en particular para las dosificaciones enzimáticas. Un analizador secuencial se compone de varios elementos.
2.1.1 Composición de un analizador secuencial 2.1.1.1 Una bandeja de toma de muestras Puede contener un número variable de cubetas
en los que se colocan las muestras a analizar.
2.1.1.2 Una bandeja de reacción Se compone de cubetas transparentes que reciben la toma de muestra de la muestra a analizar y el o los reactivos necesarios. Se mantienen en un baño térmico a temperatura constante y permiten obtener una lectura colorimétrica. Las cubetas pueden ser de un solo uso o bien limpiadas mediante un sistema de lavado antes de una nueva utilización.
2.1.1.3 Una bandeja de reactivos Soporta los depósitos de los reactivos para realizar las dosificaciones deseadas. Se colocan en un recinto refrigerado, lo que permite utilizar reactivos sensibles en el caso de los métodos enzimáticos.
2.1.1.4 Uno o varios brazos de toma de muestra Mediante un sistema de jeringa automática, permiten tomar las muestras de la bandeja de toma y los reactivos de la bandeja de reactivos, y colocarlos sucesivamente en la cubeta de reacción .
2.1.1.5 Un lector óptico Permite una medición colorimétrica de las diferentes cubetas reactivas, ya sea en momentos precisos (inicio y fin de la reacción, por ejemplo), o de forma dinámica para poder trazar una curva de reacción para cada una de ellas. En este segundo caso, la medición de la velocidad inicial de reacción puede evaluarse y utilizarse para el cálculo de la concentración del compuesto buscado.
2.1.1.6 Un módulo electrónico-informático Permite controlar el sistema y realizar los cálculos necesarios para obtener el resultado buscado.
2.1.2 Esquema analítico El esquema analítico puede ser variable. El ejemplo descrito a continuación corresponde a los casos más clásicos. Consta de las etapas siguientes: Toma de muestra La muestra de vino cuyo volumen se determina para cada dosificación se toma de la bandeja de muestra y se coloca en una cubeta de reacción.
2.1.2.1 Adición del primer reactivo El primer reactivo (R1) se toma de la bandeja de reactivos, para un volumen específico, y se añade a la cubeta de reacción. El conjunto suele homogeneizarse mediante un sistema de agitador.
2.1.2.2 Tiempo de reaación 1 La mezcla de reacción se deja en el estado actual durante un tiempo determinado (en general, de 4 a 6 minutos).
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2.1.2.3 Medición de la absorbancia Se efectúa una primera medición de absorbancia a la longitud de onda requerida. Corresponde al punto cero de la reacción ejecutada y permite tener en cuenta una eventual influencia del color del vino.
2.1.2.4 Adición del segundo reactivo El segundo reactivo (R2) se agrega a la cubeta de reacción. Éste es el que desencadena la reacción colorimétrica buscada.
2.1.2.5 Tiempo de reacción 2 La mezcla de reacción se deja en el estado actual durante un tiempo determinado (en general, de 4 a 6 minutos).
2.1.2.6 Medición de la absorbancia Se efectúa una segunda medición de absorbancia a la longitud de onda requerida. Permite medir la variación de absorbancia debida a la reacción en sí. Este esquema básico puede variar. Así, con los equipos absorbancia puede realizarse de forma dinámica con una ejemplo. Esto permite trazar una curva de reacción y medir la en condiciones analíticas precisas, puede ser proporcional a buscado.
más potentes, la medición de lectura cada 12 segundos, por velocidad inicial de reacción que, la concentración del compuesto
2.1.2.7 Cálculo de las concentraciones Para las aplicaciones enológicas, siempre se realiza por calibrado con vinos de concentración conocida de analito o soluciones sintéticas del mismo. El número de patrones de calibrado puede ser variable y más elevado si la curva de reacción no es lineal. Ciertos materiales sólo pueden utilizar un reactivo, lo que elimina la posibilidad de realización de ciertas dosificaciones para las cuales se necesitan dos reactivos distintos. Por el contrario, los equipos que permiten emplear dos reactivos pueden utilizar fácilmente uno solo si ello basta para el método considerado.
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ANEXO 1 EJEMPLOS DE MÉTODOS DE DOSIFICACIÓN HABITUALES EN ENOLOGÍA MEDIANTE ANALIZADORES AUTOMÁTICOS DE FLUJO CONTINUO
Los métodos descritos a continuación sólo se describen a modo de ejemplo, pueden utilizarse otros métodos.
1 Determinación del contenido de acidez volátil en los vinos y los mostos 1.1 Principio La acidez volátil está formada por los ácidos grasos pertenecientes a la serie acética. Los ácidos láctico, succínico, carbónico, así como el dióxido de azufre, están excluido de la acidez volátil. Los ácidos de la serie acética se separan de los constituyentes del vino por microdestilación a 98 °C bajo corriente de nitrógeno. El ácido láctico se rectifica durante la destilación. El dióxido de azufre es oxidado en ácido sulfúrico por el peróxido de hidrógeno y se elimina antes de la etapa de destilación. El gas carbónico no interfiere. El destilado de los ácidos de la serie acética se pone en presencia de un reactivo de óxido-reducción, cuyas variaciones de intensidad colorante son proporcionales al contenido de acidez volátil: yoduro de potasio o azul de bromofenol.
1.2 Material Cadena de flujos segmentada.
1.3 Reactivos y soluciones 1.3.1 Solución de peróxido de hidrógeno Peróxido de hidrógeno (N° CAS [7722-84-1]) del 30 al 35 % (o 110 vol.) Agua desmineralizada hasta alcanzar 200 ml. Conservación: 1 día.
0,5 ml
1.3.2 Solución de ácido tartárico al 5 % Acido tartárico (L, D o DL) cristalizado puro 50 g Agua desmineralizada hasta alcanzar 1.000 ml. Conservación en vial opaco: 1 mes a + 4 °C.
1.3.3 Yoduro y yodato de potasio Solución de KI (N° CAS [7681-11-0]) al 10 % (p/v) Solución de KIO3 (N° CAS [7758-05-6]) al 0,2% (p/v) Conservación en vial opaco: 1 mes. Se puede comprobar la neutralidad de las soluciones de KI y KIO3 mezclando pequeñas cantidades en un tubo. La mezcla debe permanecer incolora.
1.3.4 Azul de bromofenol Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general
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Indicador con color - Azul de bromofenol (N° CAS [115-39-9]) - Fosfato de potasio (N° CAS [7758-1-4]) 0.1 M - Tetrahidroborato de sodio (N° CAS [16940-66-2]) 0,1 M - Agua destilada hasta alcanzar 1.000 ml. Agitar y deje reposar durante 3 días protegido de la luz.
330 mg 100 ml 5 ml
Antes de la utilización, filtrar y ajustar el pH a 4,9 con la solución de tetrahidroborato de sodio.
1.3.5 Soluciones de calibrado (a elegir) 1.3.5.1 Soluciones de ácido acético (N° CAS [64-19-7]) de 0,2 a 1 g.l-1 expresado en H2SO4 (de 4 a 20 meq o de 0,28 a 1,40 g.l-1 de ácido acético) Conservación: 1 día. 1.3.5.2 Vinos de referencia de contenido de acidez volátil conocido.
1.4 Método de trabajo El diagrama de flujos. esta indicado en el anexo Las muestras no se someten a ningún tratamiento previo. La cadencia de análisis puede variar de 30 a 60 muestras por hora según el montaje utilizado.
1.5 Características del método descrito Reproducibilidad intralaboratorio: 0,05 g.l-1 de H2SO4 (0,07 g.L-1 en acide acétique) Reproducibilidad interlaboratorio: 0,10 g.l-1 de H2SO4 (0,14 g.L-1 en acide acétique)
1.6 Bibliografía DUBERNET M. Dosage automatique de l’acidité volatile dans les vins. Connaiss. Vigne et Vin, 1976,10,3, 297-309. PILONE G.J. Effect of lactic acid on volatile acid determination of wine. J. of Oenol. 1967,18, 149-156. SARIS J., MORFAUX J.N., DERVIN L. Détermination automatique de l’acidité volatile du vin. Ind. Alim. Agric., 1970, 87, 115-121.
1.7 Anexos: Ejemplos de diagramas de flujo 1.7.1 Azul de bromofenol
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1.7.2 Yoduro de potasio
2 Determinación del contenido de ácidos L-málico y L-láctico en los vinos y los mostos 2.1 Principio En presencia de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD), el ácido es oxidado en una reacción catalizada por su enzima específica:
la malato-deshidrogenasa (MDH) en el caso del ácido málico, la lactato-deshidrogenasa (LDH) en el caso del ácido láctico.
Es una reacción de equilibrio que se desplaza en el sentido de la formación de NADH mediante un tampón de hidrazina básica y un exceso de NAD. MDH L-malato + NAD+ <==> oxaloacetato de hidrazona + NADH + H+ LDH L-lactato + NAD+ <==> piruvato de hidrazona + NADH + H+ La cantidad de NADH producida es proporcional a la concentración de ácido de la muestra. Su absorbancia se mide a 340 nm.
2.2 Material Cadena de flujo continuo segmentado.
2.3 Reactivos 2.3.1 Brij 35 (N° CAS [9002-92-0]) 30% (p/v) Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general
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2.3.2 Tampón pH 9,5 aprox. Para 500 ml: Glicina pura (N° CAS [56-40-6]) Sulfato de hidrazina (N° CAS [10034-93-2]) EDTA (N° CAS [60-00-1]) Hidróxido de sodio (N° CAS [1310-73-2]) Brij 35(N° CAS[9002-92-0]) 30 % Agua bidestilada hasta alcanzar 500 ml. Filtrar si es preciso. Conservación máxima 2 meses a +4°C.
38 26 l,0 20
g g g g 5 gotas
+
2.3.3 NAD , MDH y LHD
β Nicotinamida adenina dinucleótido (forma reducida) (NAD) (N° CAS [53-84-9]) de pureza ≥ 98% MDH suspensión en sulfato de amonio (N° CAS [9001-64-3]) LDH suspensión en sulfato de amonio (N° CAS [9001-60-9]) Conservación: Vial MDH o LDH no abierto a -20 °C hasta a la fecha de caducidad. Vial abierto +4 °C como máximo 6 meses o hasta la fecha de caducidad. El polvo de NAD se conserva en seco a +4 °C hasta la fecha de caducidad.
2.3.4 Soluciones enzimáticas para el análisis
Solución NAD a 100 mg para 10 ml de agua bidestilada. Solución de MDH o LDH: 100 µl en 10 ml de agua bidestilada. Las cantidades a preparar dependen de la duración del análisis. Conservación: una semana a +4 °C. 2.3.4.1 Soluciones de referencia de ácido L-málico (N° CAS [97-67-6]) o L-láctico (N° CAS [7933-4]) de 0,5 a 5 g/l
2.4 Método de trabajo El diagrama de flujos aparece en el anexo. Las muestras no se someten a ningún tratamiento previo. En el caso de muestras que contengan materiales en suspensión, es indispensable realizar un centrifugado. La cadencia analítica es de 30 muestras por hora, al menos con tiempo de toma de muestra / tiempo de lavado = 1/1. Nota: para los vinos tintos de color intenso, debe restarse a la absorbancia medida la debida a la coloración del vino a 340 nm por tratamiento de las muestras con los reactivos sin la enzima, pero manteniendo la coenzima NAD.
2.5 Expresión de los resultados Los resultados se expresan en gramos por litro con un decimal.
2.6 Características del método descrito Reproducibilidad interlaboratorio: 0,15 g.L-1
2.7 Bibliografía Battle, J.-L. y Bouvier, J.C., Automatisation de dosages enzimatiques pour l’analyse oenologique, Revue Française d’Oenologie (Cahier Scientifique), 1986, 26, (101) : 38-43. Battle, J.-L., Joubert, R., Collon, Y. y Jouret, C., Dosage enzimatique en flux continu du Lmalate et du L-lactate dans les moûts de raisin et les vins, Ann. Fais. Exp. Chim., 1978, 71(766) : 223-228.
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Curvelo-Garcia, A. S., La fiabilité des méthodes de flux continu segmenté appliquées à l’analyse des vins et des moûts, Feuillet Vert de 1’OIV n° 941 (1993).
2.8 Anexo: Ejemplo de diagrama de flujo
ml/mn
3 Determinación del contenido de ácido tartárico en los vinos y los mostos 3.1 Principio. El método de Rebelein se aplica a muestras de vino dializadas para desarrollar un color rojo anaranjado en caliente (37 °C) con el metavanadato de sodio en medio alcalino. La absorbancia se mide a 520 nm. Pueden producirse interferencias en caso de altos contenidos de ácido málico y azúcares.
3.2 Material. Cadena de flujo continuo segmentado.
3.3
Reactivos.
3.3.1
Brij 35 (N° CAS [9002-92-0]) 30% p/v
3.3.2
Ácido acético (CH3COOH) (N° CAS [64-19-7]) puro.
3.3.3
Solución de acetato de sodio (NaCH3COO) (N° CAS [127-09-3]) al 27 %.
3.3.4
Vanadato de amonio (NH4 VO3) (N° CAS [7803-55-6])
3.3.5
Solución N de hidróxido de sodio (NaOH) (N° CAS [1310-73-2]) Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general
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3.3.6
Solución ácida de acetato de sodio
ácido acético 80 ml acetato de sodio 27 % 320 ml Brij 30 % 1 ml agua destilada hasta alcanzar 1.000 ml Conservación: 1 semana.
3.3.7
Solución de metavanadato de sodio.
vanadato de amonio 4g solución NaOH M 150 ml acetato de sodio 27% 200 ml agua destilada hasta alcanzar 500 ml. Conservación: 1 semana.
3.3.8 Soluciones de referencia de ácido D(+)-tartárico (N° CAS [147-71-7]) de 1 a 8 g/l.
3.4
Método de trabajo.
El diagrama de flujos aparece en el anexo. Las muestras no se someten a ningún tratamiento previo. En el caso de los mostos u otras muestras que contengan materiales en suspensión, es indispensable realizar un centrifugado. La cadencia analítica es de 30 muestras por hora (tiempo de toma / tiempo de lavado = 1/1).
3.5
Expresión de los resultados.
Los resultados se expresan en gramos por litro con un decimal.
3.6
Características del método descrito
Reproducibilidad interlaboratorio: 0,7 g.l-1
3.7
Bibliografía
Battle, J.-L., Joubert, R., Colion, Y. y Jouret, C., Utilisation du flux continu pour le dosage colorimétrique de l’acide tartrique dans les moûts de raisin et les vins par la méthode de Rebelein, Ann. Fals. Exp. Chim., 1978, 71(764), 155-158. Curvelo-Garcia, A.S., La fiabilité des méthodes de flux continu segmenté appliquées àl’analyse des vins et des moûts, Feuillet Vert de l’OIV N°941 (1993). Trossais J. y Asselin C. Influence des teneurs en acide malique des moûts sur le dosage de l’acide tartrique par analyse en flux continu par colorimétrie avec le métavanadate. Conn. Vigne Vin. 1985, 19, 4, 249-259.
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3.8
Anexo: Ejemplo de diagrama de flujos
4
Determinación del contenido de ácido cítrico en los vinos y los mostos
4.1 Principio El método automático para la determinación fluorimétrica del ácido cítrico se basa en el método de la diciclohexilcarbodimida (DCC). La muestra reacciona con la DCC en presencia de ácido acético en medio anhidro, lo que da lugar a la formación de aconitina. La longitud de onda de transmisión de la aconitina es de 490 nm y la longitud de onda de excitación es de 400 nm. La señal dada por el fluorímetro se envía a una interfase que está conectada al sistema software.
4.2 Material Cadena de flujo segmentada.
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4.3 Reactivos y soluciones
4.3.1 Solución de cloruro de sodio (NaCl) Cloruro de sodio (NaCl) N° CAS [7647-14-5], 4,0 g Ácido acético (CH3COOH) (N° CAS [64-19-7]) 180 cm3 Etanol (CH3CH2OH) N° CAS [64-17-5], 20 cm3 Solución de ácido cítrico 10,0 g/dm3, 30 cm3 Agua tipo I (Norma ISO 3696) o equivalente hasta alcanzar 2.000 cm3 Brij 35 (30%) N °CAS [9002-92-0], 6 cm3 Preparación: En un frasco graduado de 2.000 cm3, diluir el cloruro de sodio en aprox. 1.600 cm3 de agua. Agregar delicadamente el ácido y dejar reposar hasta alcanzar la temperatura ambiente. Agregar el etanol y la solución de ácido cítrico y mezclar. Ajustar a la marca con agua desmineralizada, agregar el brij y mezclar. Conservación: 6 meses
4.3.2 1-butanol (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3] 4.3.3 Solución de ácido acético al 1,7% (v/v) Ácido acético (CH3COOH) (N° CAS [64-19-7]) 17 cm3 1-butanol (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3] hasta alcanzar, 1000 cm3 Preparación: En el matraz de 1-butanol (1 litro), agregar el ácido con precaución. Mezclar bien. Conservación: 1 año
4.3.4 Solución Diciclohexilcarbodimida (DCC) Diciclohexilcarbodimida (C13H22N2) N° CAS [538-75-0], 41 g 1-butanol (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3] hasta alcanzar, 1000 cm3 Preparación: Pesar la diciclohexilcarbodimida en un Erlenmeyer de 1.000 cm3 y agregar el 1butanol. Mezclar bien. Conservación: 1 año
4.3.5 Brij 35 (N° CAS [9002-92-0]) 4.3.6 Solución de descontaminación 1-butanol (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3]
4.4 Preparación de la muestra desgasificar la muestra
para eliminar la mayor cantidad posible de dióxido de
carbono utilizando vacío, al menos 2 minutos con agitación.. Si la muestra está turbia debe ser filtrada.
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4.5 Soluciones de calibrado.
4.5.1 Soluciones de ácido cítrico (C6H8O7) N° CAS[77-92-9], de 0,07 a 1,00 g/dm3 en ácido cítrico Conservación: la estabilidad depende del control interno del calibrado.
4.5.2 Patrones de control de concentración conocida de ácido cítrico. Conservación: 1 mes o según el control interno
4.6 Método de trabajo El diagrama de flujo aparece en el anexo. La cadencia de análisis es de aprox. 18 muestras por hora según el montaje utilizado.
4.7 Resultados 1
Los resultados se presentan con dos decimales y se expresan en g (ácido cítrico) .L .
4.8 Características del método descrito Repetibilidad: 0,03 g (ácido cítrico) .L-1 Reproducibilidad intralaboratorio: 0,03 g (ácido cítrico) .L -1 Incertidumbre : uexp= 0.20 x concentración de la muestra en g (ácido cítrico) .L-1
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4.9 Anexo: Ejemplo de diagrama de flujo Bomba Debitos
Fregadero
ml/min
Fluorometro Emisión 490 nm extinción à 400 nm 2 mm d'épaisseur celular
Acido acético
DCC aire n-butanol aire cloruro de sodio muestra
Catador
fregadero
fregadero o * Membrana de dialysis, Ref SA5283 ** Tubo bomb en aciflex
5 Determinación del contenido de glucosa y fructosa en los vinos y los mostos 5.1
Principio.
El método de dosificación permite determinar la concentración de glucosa y fructosa por separado o la suma de estas dos concentraciones en los vinos o los mostos.
5.1.1
Fosforilación de la glucosa y la fructosa.
Esta reacción se catalizada por hexoquinasa (HK): HK glucosa + ATP <==> glucosa-6-fosfato + ADP (1) HK fructosa + ATP <=> fructosa-6-fosfato +ADP ATP: ADP:
adenosina trifosfato. adenosina difosfato.
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5.1.2
Oxidación de la glucosa-6-fosfato(G-6-P).
Se realiza por la acción de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP), en presencia de su enzima específica glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). G6PDH G-6-P + NADP+ <==> gluconato-6-fosfato + NADPH + H+ (2) La reacción de equilibrio se desplaza en el sentido de la formación de NADPH, gracias a la elección de unas condiciones adecuadas (tampón pH 7,6 y exceso de NADP). El NADPH proporcional a la concentración de glucosa en la muestra se dosifica midiendo su absorción a 340 nm.
5.1.3
Isomerización de la fructosa-6-fosfato.
Esta reacción permite dosificar la suma glucosa + fructosa. La enzima utilizada es la fosfoglucosa-isomerasa (PGI). PGI fructosa-6-fosfato <==> glucosa-6-fosfato (3) La glucosa-6-fosfato formada reacciona la NADP según (2) para formar NADPH, que se dosifica a 340 nm.
5.2
Material.
Cadena de flujo continuo segmentada.
5.3
Reactivos y soluciones.
En el mercado existen numerosos proveedores de kits con los reactivos preparados. A continuación presentamos un ejemplo cualquiera de los mismos.
5.3.1
Vial 1:
Liofilizado compuesto de:
5.3.2
Tampón trietanolamina pH = 7,6 NADP (N° CAS [53-59-8]) 64 mg ATP (N° CAS [987-65-5]) 16O mg Sulfato de magnesio MgSO4 (N° CAS [7487-88-9]) Estabilizadores.
Vial 2:
0,7 ml de suspensión enzimática compuesta de:
5.3.3
Hexoquinasa (N° CAS [9001-51-8]) aprox. 200 U Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (N° CAS [9001-40-5]) 100 U en solución en sulfato de amonio.
Vial 3:
0,7 ml de fosfoglucosa-isomerasa (N° CAS [9001-41-6]) (aprox. 490 U) en suspensión en sulfato de amonio.
5.3.4
Vial 4:
7 ml de solución estándar de D-glucosa (N° CAS [50-97-7]) a 0,5 g-1. Conservación del estuche no abierto a -20 °C hasta la fecha de caducidad.
5.3.5
Solución tampón NAD/ATP. Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general
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Se prepara a partir del kit enzimático: Disuelva el contenido del vial 1 en 90 ml de agua bidestilada. Conserve el tampón diluido a -20 °C durante 3 meses como máximo.
5.3.6
Preparación de las soluciones de enzimas para la dosificación.
Ejemplo de volúmenes que deben prepararse para el montaje propuesto: Dosificaciones
Fructosa y glucosa + fructosa
Duración del análisis 1 hora 4 horas 8 horas
Glucosa tampón NAD/ATP 15 ml 60 ml 120 ml
HK/G6PDH 100 µl 500 µl 1.000 µl
PGI 100 µl 500 µl 1.000 µl
La dosificación de la fructosa precisa pasar dos veces de los patrones y las muestras, duplicándose así el tiempo de análisis respecto a la dosificación de la glucosa. Conservación de las soluciones de enzimas para la dosificación: una semana a +4°C.
5.3.7
Soluciones patrón.
5.3.7.1 Solución madre a 10,0 g/l Basta utilizar glucosa sola para el calibrado: la isomerización de la fructosa se hará únicamente para las muestras.
D-glucosa anhidro 2,50 g Agua destilada asta alcanzar 250 ml Isotiocianato de alilo (conservante) (N° CAS [57-06-7])
2 gotas.
5.3.7.2 Soluciones hijas de glucosa: Patrón a 3 g/l: 15 ml de solución madre en un matraz de 50 ml Patrón a 2 g/l: 10 ml de solución madre en un matraz de 50 ml Patrón a 1 g/l: 10 ml de solución madre en un matraz de 100 ml A continuación, estas soluciones se completan hasta la línea de nivel con agua destilada. Patrón a 0,50 g/l: solución estándar del estuche enzimático Conservación: a + 4 °C durante 1 mes.
5.4
Método de trabajo.
El diagrama de flujos aparece en el anexo. La cadencia analítica es de 60 muestras por hora con un tiempo de toma / lavado = 1/1. Las muestras de vino no se someten a ningún tratamiento previo. En el caso de los mostos o de otras muestras que contengan de materias en suspensión, es indispensable una filtración previa.
5.5
Expresión de los resultados.
La concentración de glucosa, fructosa o glucosa + fructosa se indica en g.L-1 con un decimal.
5.6
Bibliografía
Battle J.L., Bouvier J.C. Rev. Fr. Oenol., 1986, 101, 38-43.
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5.7
Anexo: ejemplo de diagrama de flujo
6
Determinación del contenido de dióxido de azufre libre y total en los vinos y los mostos después de diálisis
6.1
Principio.
Tras acidificación del vino, el dióxido de azufre libre se difunde a través de una membrana de diálisis. El dióxido de azufre combinado se libera mediante una hidrólisis alcalina. Las dos dosificaciones se efectúan a 560 nm en presencia de p-rosanilina (o fuschina básica). La segmentación se realiza con nitrógeno para de evitar la oxidación. SO2 + rosanilina ŕ> complejo incoloro + formaldehído ŕ> complejo con color. El método es aplicable para una gama LOQ a 200 mg.l-1.
6.2
Material.
Cadena de flujos segmentada.
6.3
Reactivos y soluciones.
6.3.1
Reactivo específico para la dosificación del dióxido de azufre libre.
6.3.1.1 Solución al 10 % de ácido sulfúrico (pureza 98%)
H2SO4 (N° CAS [57-06-7])
20 ml
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agua destilada hasta alcanzar
6.3.2
200 ml.
Reactivos específicos para la dosificación del dióxido de azufre total.
6.3.2.1 Solución de hidróxido de sodio 4 M NaOH (N° CAS [1310-73-2]) 40 g agua destilada hasta alcanzar 250 ml. Conservación: 1 semana.
6.3.2.2 Solución de ácido sulfúrico (N° CAS [57-06-7]) al 1/2 (v/v) Conservación: 1 mes.
6.3.3
Reactivos comunes
6.3.3.1
Nitrógeno tipo R (N° CAS [7727-37-9])
6.3.3.2 Solución de ácido sulfúrico (N° CAS [57-06-7]) al 1% (v/v) Conservación: 1 mes. 6.3.3.3 Solución de formaldehído al 6 % (v/v) formaldehído al 37 % mínimo (N° CAS [50-00-0]) agua destilada hasta alcanzar 200 ml. Conservación: 1 día en vial cerrado.
1,2 ml
6.3.3.4 Rosanilina (reactivo coloreado).
Solución madre: 2 g/l de fuschina básica (o clorhidrato de rosanilina) (N° CAS [632-995]) Agite y deje reposar 3 días y conserve protegido de la luz. Conservación: 3 meses en vial opaco.
Solución de trabajo
solución madre 40 ml ácido ortofosfórico (N° CAS [7664-38-2]) 62 ml agua destilada hasta alcanzar 500 ml. Conservación: 2 semanas en vial opaco. Nota: Esta preparación es fuertemente exotérmica. Tome las precauciones correspondientes.
6.3.4 Soluciones patrón sintéticas. 6.3.4.1
Solución ácida de pH 3, aproximadamente.
H2SO4 1 % (N° CAS [57-06-7])
5m1
agua destilada hasta alcanzar 1.000 ml. Esta solución servirá para completar los matraces patrón de SO2. Conservación: 1 día. -1
6.3.4.2 Solución madre de 300 mg.l de SO2
disulfito de sodio puro (N° CAS [7681-57-4])
solución pH 3 hasta alcanzar 500 ml.
227 mg
Conservación: 1 día.
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6.3.4.3 Soluciones patrón hijas. Ejemplo de preparación de una solución patrón de 120 mg.l-1:
solución madre de 300 mg.l-1
solución pH3
agua destilada hasta alcanzar 125 ml.
6.3.5
50 ml 40 ml
Patrones de vinos.
Vinos de referencia o controlados por el método de referencia.
6.4
Método de trabajo.
En el anexo aparecen los diagramas de flujos. Las muestras no se someten a ningún tratamiento previo. La cadencia analítica puede alcanzar las 60 muestras por hora con un tiempo de lavado / toma de muestra = 2/1 Nota: Al término del análisis, enjuagar el circuito analítico con agua durante al menos 10 min. Cada vez que sea necesario, lavar el circuito con agua y lejía a 1/20 durante 30 min como mínimo. Aclarar con agua durante 2 h, como mínimo.
6.5
Expresión de los resultados.
Los valores de dióxido de azufre se expresan en mg por litro sin decimal.
6.6
Características del método descrito
Reproducibilidad interlaboratorio dióxido de azufre libre: 7 mg.L-1 Reproducibilidad interlaboratorio dióxido de azufre total: 27 mg.L-1
6.7
Bibliografía
DUBERNET M., 1997. L’automatisation de l’analyse chimique en œnologie. Revue Française d’Œnologie, 66, 45-61. Scholten G., Woller R., Holbach B. Automatisierte weinanalyse, 2. Mittteilung. Die Wein. Wiss., 1982, 38, 397-426.
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6.8
Anexo: ejemplos de diagrama de flujo
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7
Determinación del contenido de dióxido de azufre libre y total en los vinos y los mostos por destilación
7.1
Principio
Existe una alternativa ampliamente aplicada al método anterior. Consiste en sustituir la diálisis por una destilación en una microcolumna. En el caso del dióxido de azufre total, deja de realizarse la hidrólisis alcalina, y la liberación de la totalidad del dióxido de azufre se logra mediante una acidificación más potente y por una temperatura de destilación superior.
7.2
Reactivos y soluciones.
7.2.1
Reactivo específico para la dosificación del dióxido de azufre libre.
7.2.1.1 Solución al 1 % de ácido sulfúrico (pureza 98%)
H2SO4 (N° CAS [57-06-7]) 2 ml agua destilada hasta alcanzar 200 ml.
7.2.2
Reactivo específico para la dosificación del dióxido de azufre total.
7.2.2.1
Solución de ácido sulfúrico (N° CAS [57-06-7]) al 20 % (v/v)
Conservación: 1 mes.
7.2.3
Reactivos comunes
7.2.3.1
Nitrógeno tipo R (N° CAS [7727-37-9])
7.2.3.2 Solución de ácido sulfúrico (N° CAS [57-06-7]) al 1% (v/v) con adición de 4 gotas por litro de humectante Brij 35 (N° CAS [9002-92-0]) Conservación: 1 mes. 7.2.3.3
Solución de formaldehído
formaldehído al 40 % (N° CAS [50-00-0]) agua destilada hasta alcanzar 1.000 ml. Conservación: 1 día en vial cerrado . 7.2.3.4
Solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0,2 M
Hidróxido de sodio (N° CAS [1310-73-2])
Brij 35 (N° CAS [9002-92-0])
agua destilada hasta alcanzar 500 ml.
7.2.3.5
10 ml
4g 2 gotas
Rosanilina (reactivo coloreado).
Solución madre: 2 g/l de fuschina básica (o clorhidrato de rosanilina) (N° CAS [632-995]) Agite y deje reposar 3 días y conserve protegido de la luz. Conservación: 3 meses en vial opaco.
Solución de trabajo
solución madre 70 ml ácido ortofosfórico H3PO4 (N° CAS [7664-38-2]) 70 ml agua destilada hasta alcanzar 500 ml. Conservación: 2 semanas en vial opaco. Nota: esta dilución es muy exotérmica. Tome las precauciones correspondientes.
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7.2.4
Soluciones patrón sintéticas.
7.2.4.1 Solución ácida de pH 3, aprox.
H2SO4 1 % (N° CAS [57-06-7])
5 ml
agua destilada hasta alcanzar 1.000 ml. Esta solución servirá para completar los matraces patrón de SO2. Conservación: 1 día. 7.2.4.2
-1
Solución madre de 300 mg.l de SO2
disulfito de sodio puro Na2S2O5 (N° CAS [7681-57-4])
solución pH 3 hasta alcanzar
227 mg
500 ml.
Conservación: 1 día. 7.2.4.3
Soluciones patrón hijas.
Ejemplo de preparación de una solución patrón a 120 mg.l-1:
solución madre de 300 mg.l-1
50 ml
solución pH3
40 ml
agua destilada hasta alcanzar
125 ml.
7.2.5
Patrones de vinos.
Vinos de referencia o controlados por el método de referencia.
7.3
Expresión de los resultados.
Los valores de dióxido de azufre se expresan en mg por litro sin decimal.
7.4
Características del método descrito
Reproducibilidad interlaboratorio dióxido de azufre libre: 7 mg.l-1 Reproducibilidad interlaboratorio dióxido de azufre total: 27 mg.l-1
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7.5
Anexo: ejemplos de diagrama de flujo
Dosificación del dióxido de azufre libre
Cadencia: 90 mues./hora Relación toma/aclarado: 1/1
Columna de destilación 5 veces Nitrógeno para arrastre Caudal: 40 ml/min Refrigerante (agua fría)
Bomba ml/min 0,16
Muestra
1,40
H2SO4 1%
0,05
20 veces
1,60 0,05
Desagüe
5 veces
5 veces
Colorímetro 560 nm
5 veces
2,50
NaOH 0,2 M Nitrógeno para burbujeo
0,60 1,20 0,32 0,32
Baño maaría 48° C ± 5° C
Nitrógeno para burbujeo
H2SO4 1% + Brij Formaldehído Para-rosanilina
0,80 Reinicio colorímetro
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Dosificación del dióxido de azufre total
Columna de destilación Refrigerante (agua fría)
Nitrógeno de arrastre Caudal: 40 ml/min
Baño maría 105° C ± 5° C
Cadencia: 90 mues./hora Relación toma/aclarado: 1/1
Bomba ml/min
20 veces
0,16
Muestra
1,40
H2SO4 10%
0,05 1,40 0,05
Desagüe
Colorímetro 560 nm
3 x 20 veces
5 veces
2,00
Nitrógeno para burbujeo bullage NaOH 0,2 N Nitrógeno para burbujeo
0,60 1,20 0,32 0,32
H2SO4 1% + Brij Formaldehído Para-rosanilina
0,80 Reinicio colorímetro
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ANEXO 2 EJEMPLOS DE MÉTODOS DE DOSIFICACIÓN HABITUALES EN ENOLOGÍA MEDIANTE ANALIZADORES SECUENCIALES Los métodos descritos a continuación sólo se describen a modo de ejemplo, pueden utilizarse otros métodos.
1 1.1
Dosificación del ácido acético en los vinos y los mostos
Principio
Método enzimático. En presencia de ATP, el ácido acético se transforma en acetil-fosfato en una reacción catalizada por el acetato quinasa. (1) Acetato + ATP —Acetato quinasa Acetil-fosfato + ADP La ADP formada por esta reacción se retransforma en ATP por reacción con fosfenolpiruvato en presencia de piruvato quinasa. (2) ADP + Fosfenolpiruvato —Piruvato quinasa Piruvato + ATP El piruvato se reduce a L-lactato por la nicotinamida-adenina-nucleótido reducido (NADH) en presencia de lactato-deshidrogenasa. (3) Piruvato + NADH + H+ —Lactato deshidrogenasa Lactato + NAD+ + H2O La cantidad de NADH oxidada en la reacción (3) se determina midiendo la absorbancia a 340 nm, y es proporcional a la concentración de ácido acético del vino. Una cuarta reacción permite mantener el equilibrio de la reacción 1 en el sentido de formación de acetilfosfato por eliminación de este último. (4) Acetil-fosfato + CoA —Fosfotransacetilasa Acetil-CoA + Fosfato inorgánico Se añade polivinilpirrolidona (PVP) al medio reactivo para eliminar las interferencias debidas a los compuestos fenólicos del vino.
1.2
Reactivos
1.2.1
Preparación del tampón MOPS
Añadir : 13 g de MOPS (Ácido N-morfolino-3-propano sulfónico) CAS [1132-61-2] 500 mg de cloruro de magnesio, 6H2O - CAS [7791-18-6] 1,5 g de cloruro de potasio (KCl) - CAS [7447-40-7] 250 ml de agua bidestilada Ajustar el pH a 4,75 con una solución 1,5 M de hidróxido de potasio (KOH) - CAS [1310-58-3]. Esperar 5 minutos y reajuste de nuevo el pH a 7,45. Completar hasta 300 ml con agua bidestilada. Estabilidad del tampón: 60 días a ± 4 °C.
1.2.2
Preparacion de los reactivos
1.2.2.1 Reactivo 1 (R1): Añadir a 100 ml de tampón MOPS 400 mg de polivinilpirrolidona (PVP) - CAS [9003-39-8].
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1.2.2.2 Reactivo 2 (R2) Añadir a 100 ml de tampón MOPS: De 300 a 350 mg de adenosina-5-trifosfato, sal disódica (ATP) - CAS [987-65-5] 50 mg de fosfo-enolpiruvato de triciclohexilamonio (PEP) - CAS [35556-70-8] 38 mg de β nicotinamida adenina dinucleótida (forma reducida) (NADH) - CAS [606-68-8] Pureza ≥ 98% 25 mg de sal de trilitio de coenzima A - CAS [18439-24-2] -pureza 2 400 unidades aprox. de piruvato quinasa (PK) - CAS [9001-60-9] y lactato deshidrogenasa (LDH) - CAS [9001-60-9] 600 unidades aprox. de fosfotransacetilasa (PTA) - CAS [9029-91-8] 230 unidades de acetato quinasa (AK) - CAS [9027-42-5] Estabilidad del reactivo: unas 12 horas a + 4 °C.
1.3
Preparación de las muestras
Las muestras de vinos se diluyen previamente a 1/10.
1.4
Procedimiento analítico
Puede variar en función del material utilizado. La descripción siguiente debe considerarse un ejemplo. El volumen de las cubetas de reacción es de 300 µl. El ciclo analítico es de 10 minutos, esto es, 50 ciclos de la bandeja reactiva. Se efectúa una lectura colorimétrica cada 12 segundos, esto es, cada ciclo de la bandeja reactiva, para poder trazar la curva de reacción
1.4.1
Programación
La longitud El volumen El volumen El volumen El volumen
1.4.2
de onda de lectura es de 340 nm. de muestra diluido al 1/10, añadido en el momento cero, es de 20 µl. de reactivo R1 añadido en el momento cero es de 111 µl. de reactivo R2 añadido al cabo de 5 minutos es de 125 µl. reactivo total es de 256 µl.
Calibrado
El calibrado se realiza en 4 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución al 9 ‰ de cloruro de sodio - CAS [7647-14-15]. Los otros tres calibradores son soluciones de concentraciones crecientes de ácido acético puro - CAS [64-19-7] (0,25 g.l-1; 0,50 g.l-1; 1 g.l-1) o vinos patrón con una concentración conocida de ácido acético.
1.4.3
Resultados
La figura siguiente muestra la curva de reacción obtenida.
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En las condiciones de medición utilizadas, la curva de reacción observada tras la adición del reactivo R2 es una recta, en la escala de trabajo elegida (de 0 a 1 g/l). Traduce la velocidad inicial de reacción, proporcional a la concentración de ácido acético. La medición de la pendiente de esta recta puede realizarse leyendo dos puntos en las vueltas N° 27 y 50. El valor de la concentración de ácido acético vendrá dado por la fórmula: C = K (L1-L2) En la que K es un factor de reacción calculado por el equipo tras cada calibración según la fórmula siguiente:
K
CEt CB AEt AB
en la que: AB = absorbancia del blanco CB = concentración del blanco AEt = absorbancia del patrón CEt = concentración del patrón Los resultados se indican en g.l-1 de ácido acético.
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1.5
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 0,04 g.L-1 Reproducibilidad interlaboratorio: 0,10 g.L-1
1.6
Bibliografía
DONECHE B., y SANCHEZ P.J., 1985 : Automatisation en flux continu du dosage enzymatique de l’acide acétique dans les vins, Connaissance de la vigne et du vin, 1985 ; n°3, 161-169. DUBERNET M., PENNEQUIN F. y GRASSET F., 1997 Adaptation du dosage de l’acide acétique dans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717, Feuillet vert OIV N°1001 McCLOSKEY Leo P., 1980 : An improved enzymatic assay for acetate in juice and wine, Am. J. Enol. Vitic. Vol 31, N° 2, 1980, pp 170-173.
2 2.1
Dosificación del dióxido de azufre total en los vinos y los mostos Principio
Método químico. La muestra a dosificar se diluye en una solución tampón fosfato de pH 8. Tras estabilización, se añade al medio de reacción una solución tamponada de ácido DTNB (5,5’-ditio-bis(2-ácido nitrobenzoico) (3,3’-6)) o BIS (3-carboxi-4-nitrofenil) disulfido, conocido con la expresión «reactivo de Ellman». Se trata de un reactivo específico que permite la modificación y la detección cuantitativa de los enlaces disulfuros, cuya fórmula desarrollada es: O
OH
O2N
S S
NO2 O
OH
La reacción desarrolla una coloración amarilla medible a una longitud de onda de 405 nm.
2.2
Protocolo de medición
2.2.1
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita la utilización de dos reactivos y permita una medición a 405 nm.
2.2.2
Reactivos
Se utilizan dos reactivos:
Reactivo 1
K2HPO4 (CAS [7758-11-4]) 17,4 g Agua bidestilada hasta alcanzar 1.000 ml
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El pH de la solución tampón preparada de este modo se ajusta por adición de H3PO4 puro (CAS nº [7664-38-2]) para obtener una valor de 8 (diferencia máxima tolerable: ± 0,2 unidad pH).
Reactivo 2
DNTB (CAS [69-78-3]) 760 mg Reactivo 1 900 ml Etanol puro 100 ml
2.2.3
Aplicación
El cuadro siguiente resume las diferentes cantidades de muestra de vino y de reactivos que deben añadirse en la cubeta de reacción a lo largo del tiempo: Tiempo en minutos 0 5
Muestra en µl
Reactivo 1 en µl 80
8
Reactivo 2 en µl
Agua bidestilada en µl 170
80
La lectura de la absorbancia a 405 nm se efectúa periódicamente a lo largo del tiempo, con una duración total de 10 minutos, pero que puede acortarse habida cuenta de la rapidez de la reacción, prácticamente instantánea. El gráfico siguiente muestra el tipo de curva de reacción obtenida: Curva reactiva 8000
7000
Do (Valeurs relatives) 6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
12
36
60
84
108
132
156
180
204
228
252
276
300
324
348
372
396
420
444
468
492
516
540
564
588
Tiempo en segundos
Tras la adición del reactivo N° 1, la estabilización es rápida. Tras la adición del reactivo N° 2, que contiene el DNTB, se produce una reacción coloreada inmediata, cuya meseta se alcanza en algunos segundos. A continuación se estabiliza. La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia DO 1 leída tras la estabilización del reactivo N° 1 y la absorbancia DO 2 leída en la meseta. Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido en SO2 total de la muestra utilizada.
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El calibrado se realiza con vinos patrón con valores de SO2 total conocidos y que cubren la gama de medición considerada, o bien mediante soluciones de metabisulfito de potasio (N° CAS[16731-55-8]) estabilizadas en medio sulfúrico al 1 % y de concentración conocida. En general, al no ser totalmente lineal la curva de calibración, se precisan de 4 a 5 puntos de calibración. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N° CAS [764714-5]) al 9 ‰.
2.3
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 12 mg.L-1 Reproducibilidad interlaboratorio: 20 mg.L-1
2.4
Bibliografía
ELLMAN G.L., 1959. For the modification and quantitative detection of sulfhydryl groups ; Arch. Biochem. Biophys. 82,70. DUBERNET M., LEBOEUF J.P. y GRASSET F., 1998. Méthode automatisée de dosage colorimétrique du dioxyde de soufre total dans les vins. FV N° 1068 OIV. DUBERNET M., PENNEQUIN F. y GRASSET F., 1995. Adaptation du dosage du dioxyde de soufre total dans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717. FV N° 997 OIV.
3 3.1
Dosificación del dióxido de azufre libre en los vinos y los mostos Principio
Método químico. El dióxido de azufre libre se estabiliza en medio ácido. Su dosificación se efectúa por el desarrollo, en presencia de formaldehído, de una coloración rosa por combinación con la fuschina previamente decolorada en medio fosfórico. Se corrige una reacción parasitaria en la dosificación debida a los compuestos fenólicos presentes en el vino.
3.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita utilizar dos reactivos y una medición a 570 nm.
3.3
Reactivos
Se emplean dos reactivos:
3.3.1
Reactivo 1
3.3.1.1
Solución madre de fuschina básica (clorhidrato de rosanilina)
Clorhidrato de rosanilina (N° CAS [632-99-5]) 2g Agua bidestilada hasta alcanzar 1.000 ml Conservación: 6 meses en la nevera 3.3.1.2
Solución de trabajo (R1)
Solución madre de fuschina básica Ácido fosfórico (CAS [7664-38-2]) al 10% Agua bidestilada
3 ml 77 ml 20 ml
Conservación: 5 días a 4° C y protegido de la luz.
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3.3.2
Reactivo 2
Formaldehído (N° CAS [50-00-0]) 5 ml Agua bidestilada hasta alcanzar 1.000 ml Conservación: 1 semana a temperatura ambiente.
3.4
Preparación de las muestras
Las muestras de vino no se diluyen. Se recomienda proceder al análisis lo más rápidamente posible tras la toma de mustra para evitar pérdidas de dióxido de azufre libre.
3.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 570 nm. La secuencia analítica es la siguiente: Ciclo Ciclo Ciclo Ciclo Ciclo
3.6
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino de 20 µl 1 (12 segundos): adición de 250 µl de reactivo R1 24 (288 segundos): lectura DO1 a 570 nm 25 (300 segundos): adición de 106 µl de reactivo R2 28 (336 segundos): lectura DO2 a 570 nm
Calibrado
Se realiza en dos puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N° CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. El valor estándar viene dado por una solución periódicamente valorada de metabisulfito de potasio (N° CAS [16731-55-8]), estabilizada en medio sulfúrico al 1 % y de concentración de 50 mg.l-1, aprox.
3.7
Lectura de los resultados
El esquema siguiente muestra la evolución de la absorbancia a 570 nm.
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Se constata que la mezcla del vino con la solución de fuschina provoca una primera reacción coloreada que genera un aumento de la absorbancia (reacción N°1). La importancia de la misma es proporcional a la riqueza del vino en compuestos fenólicos y constituye un efecto parasitario. La reacción N° 2 ocurre tras la adición del reactivo R2 y corresponde estrictamente a la combinación del dióxido de azufre libre y la fuschina. Sólo debe tenerse en cuenta ésta última. La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia de base DO 1 y la absorbancia DO 2. Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido en SO2 libre de la muestra utilizada.
3.8
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 6 mg.L-1 Reproducibilidad interlaboratorio: 12 mg.L-1
3.9
Bibliografía
DUBERNET M., PENNEQUIN F. y GRASSET F., 1995. Dosage du dioxyde de soufre libre dans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717. FV N° 998 OIV.
4 4.1
Dosificación de la glucosa y la fructosa en los vinos y los mostos Principio
Método enzimático. La glucosa y la fructosa se fosforilan en presencia de adenosina trifosfato (ATP). La reacción es catalizada por hexoquinasa (HK) y produce respectivamente glucosa-6-fosfato (G6P) y fructosa6-fosfato (F6P). HK 1) Glucosa + ATP ------> G6P + ADP HK 2) Fructosa + ATP ------> F6P + ADP La glucosa-6-fosfato se oxida a gluconato-6-fosfato en presencia de nicotinamida-adenosinadinucleótido (NAD+). La reacción es catalizada por glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). G6PDH 3) G6P + NAD -----> gluconato-6-fosfato + NADH + H+ La fructosa-6-fosfato se transforma en glucosa-6-fosfato en presencia de fosfoglucosa isomerasa (PGI) PGI 4) F6P -----> G6P El aumento de la absorbancia a la longitud de onda 340 nm es proporcional a la cantidad de Dglucosa y D-fructosa presente.
4.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita utilizar reactivos y realizar una medición a 340 nm.
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4.3
Reactivos
Los fabricantes suelen ofrecer los reactivos utilizados en forma de kit enzimático, lo que facilita su utilización por parte de los laboratorios. Ejemplo:
Reactivo 1 (30 ml) Solución tampón pH 7,5 NAD (N° CAS [53-84-9]) ATP (N° CAS [987-65-5])
70 mg 90 mg
Reactivo 2 (0,6 ml) HK (N° CAS [9001-51-8]) 160 U y G6PDH (N° CAS [9001-40-5]) 200 U
Reactivo 3 (0,6 ml) PGI (N° CAS [9001-41-6]) 380 U
El reactivo único utilizado en el equipo se prepara añadiendo los 3 reactivos del estuche, a los que se incorporan 900 mg de PVP (Polivinilpirolidona) (N° CAS [9003-39-8]). En el caso citado, permite realizar unos 600 tests. Su conservación es de 1 mes a +8 °C.
4.4
Preparación de las muestras
Las muestras de vino se diluyen 10 veces. Las muestras de mostos se diluyen de manera que se obtenga una concentración inicial inferior a 1 g.l-1.
4.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 340 nm. La secuencia analítica es la siguiente:
4.6
Ciclo 1 (6 segundos): toma de la muestra de vino de 5 µl
Ciclo 1 (12 segundos): adición de 50 µl de reactivo y 200 µl de agua desmineralizada
Ciclo 1: lectura de absorbancia DO1 a 340 nm
Ciclo 50 (600 segundos): lectura de absorbancia DO2 a 340 nm
Calibrado
Se realiza en 4 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N° CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. Los valores estándar vienen dados por soluciones de glucosa (N° CAS [50-99-7]) y fructosa (N° CAS [57-48-7]) (50/50) que cubren la gama de 0 a 10 g.l-1 diluidas 10 veces en el momento de su utilización., El calibrado puede efectuarse tambien con vinos de concentraciones conocidas.
4.7
Lectura de los resultados
La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia DO 2 y la absorbancia de base DO 1. Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido de glucosa y fructosa de la muestra utilizada. El resultado se expresa en g de glucosa + fructosa por litro.
4.8
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 0,3 g.L-1 de 0 a 5 g.L-1 y 0,6 L-1 por encima de 5 g.L-1. Reproducibilidad interlaboratorio: 0,35 g.L-1 de 0 a 2 g.L-1
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5 5.1
Dosificación del ácido L-málico en los vinos y los mostos
Principio
En presencia de nicotinamida-adenosinaŔdinucleótido (NAD+), el ácido L-málico se oxida a oxaloacetato en una reacción catalizada con L-malato deshidrogenasa (L-MDH). El equilibrio de la reacción es favorable al malato. El desplazamiento del equilibrio de la reacción en el sentido de la formación de oxaloacetato se realiza por eliminación del oxaloacetato que, en presencia de L-glutamato, se transforma en L-aspartato. Esta reacción es catalizada por glutamatooxaloacetato-transaminasa (GOT). 1) L-malato + NAD+ -> oxaloacetato + NADH + H+ (en presencia de L-malato deshidrogenasa) 2) Oxaloacetato + L-glutamato -> L-aspartato + 2-oxoglutarato (en presencia de GOT) La formación de NADH, medida por el aumento de la absorbancia a la longitud de onda 340 nm, es proporcional a la cantidad de L-malato presente.
5.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita realizar una medición a 340 nm.
5.3
Reactivos
Los fabricantes suelen ofrecer los reactivos utilizados en forma de estuche enzimático, lo que facilita su utilización por parte de los laboratorios. Ejemplo.
Reactivo 1 (30 ml) Solución tampón pH 10 / ácido glutámico (N° CAS [56-86-0]) 440 mg
Reactivo 2 (6 ml) NAD (N° CAS [53-84-9]) 210 mg
Reactivo 3 (0,6 ml) L-MDH (N° CAS [9001-64-3]) 2400 U / GOT (N° CAS [9000-97-9]) 160 U
El reactivo único utilizado en el equipo se prepara por adición de los 3 reactivos del estuche, a los que se incorporan 300 mg de PVP (polivinilpirolidona) (N° CAS [9003-39-8]). Su conservación es de 1 mes a 8 °C.
5.4
Preparación de las muestras
Las muestras de vino o mosto se diluyen 10 veces.
5.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 340 nm.
La secuencia analítica es la siguiente: Ciclo Ciclo Ciclo Ciclo
5.6
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino de 5 µl 1 (12 segundos): adición de 20 µl de reactivo y 200 µl de agua desmineralizada 1: lectura absorbancia DO1 a 340 nm 50 (600 segundos): lectura absorbancia DO2 a 340 nm
Calibrado
Se realiza en 3 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N° CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. Los valores estándar vienen dados por soluciones de ácido L-málico
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(N° CAS [97-67-6]) que cubren la gama de 0 a 3,5 g.l-1 diluidas 10 veces en el momento de su utilización. , El calibrado puede efectuarse tambien con vinos con concentraciones conocidas.
5.7
Lectura de los resultados
La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia DO 2 y la absorbancia de base DO 1. Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido de ácido L-málico de la muestra utilizada. El resultado se expresa en g de ácido L-málico por litro.
5.8
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 0,4 g.l-1. Reproducibilidad interlaboratorio: 0,6 g.l-1
6 6.1
Dosificación del ácido L-láctico en los vinos y los mostos
Principio
Método enzimático. En presencia de nicotinamida-adenosina-dinucleótido (NAD), el ácido L-láctico se oxida a piruvato en una reacción catalizada con L-lactato deshidrogenasa (L-LDH). El equilibrio de la reacción es favorable al lactato. La eliminación del piruvato del medio reactivo desplaza el equilibrio de la reacción en el sentido de la formación de piruvato. En presencia de L-glutamato, el piruvato se transforma en L-alanina. Esta reacción es catalizada con glutamato-piruvatotransaminasa (GPT). 1) L-lactato + NAD+ -> piruvato + NADH + H+ (en presencia de L-lactato deshidrogenasa) 2) Piruvato + L-glutamato -> L-alanina + 2-oxoglutarato (en presencia de GPT) La formación de NADH, medida por el aumento de la absorbancia a la longitud de onda 340 nm, es proporcional a la cantidad de lactato presente.
6.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita realizar una medición a 340 nm.
6.3
Reactivos
Los fabricantes suelen ofrecer los reactivos utilizados en forma de kit enzimático, lo que facilita su utilización por parte de los laboratorios. Ejemplo:
Reactivo 1 (30 ml) Solución tampón pH 10 / ácido glutámico (N° CAS [56-86-0]) 440 mg
Reactivo 2 (6 ml) NAD (N° CAS [53-84-9]) 210 mg
Reactivo 3 (0,6 ml) GPT (N° CAS [9000-86-6]) 1100 U
Reactivo 4 (0,6 ml) L-LDH (N° CAS [9001-60-9]) 3800 U
El reactivo único utilizado en el equipo se prepara por adición de los 4 reactivos del estuche, a los que se incorporan 300 mg de PVP (Polivinilpirolidona) (N° CAS [9003-39-8]). Su conservación es de 1 mes a 8°C.
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6.4
Preparación de las muestras
Las muestras de vino o de mosto se diluyen 10 veces.
6.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 340 nm. La secuencia analítica es la siguiente: Ciclo Ciclo Ciclo Ciclo
6.6
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino de 5 µl 1 (12 segundos): adición de 20 µl de reactivo y 200 µl de agua desmineralizada 1: lectura absorbancia DO1 a 340 nm 50 (600 segundos): lectura absorbancia DO2 a 340 nm
Calibrado
Se realiza en 3 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de Cloruro de sodio (N° CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. Los valores estándar vienen dados por soluciones de ácido L-láctico (N° CAS [79-33-4]) que cubren la gama de 0 a 1,2 g.l-1 diluidas 10 veces en el momento de su utilización. , El calibrado puede efectuarse también con vinos con concentraciones conocidas.
6.7
Lectura de los resultados
La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia DO 2 y la absorbancia de base DO 1. Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido de ácido L-láctico de la muestra utilizada. El resultado se expresa en g de ácido L-láctico por litro.
6.8
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 0,2 g.L-1. Reproducibilidad interlaboratorio: 0,5 g.L-1
7 7.1
Dosificación de los compuestos fenólicos totales en los vinos por índice de Folin-Ciocalteu Principio
Método químico. El reactivo de Folin-Ciocalteu oxida el conjunto de los compuestos fenólicos presentes en el vino. Dicho reactivo está formado por una mezcla de ácido fosfotúngstico y de ácido fosfomolíbdico, que durante la oxidación de los fenoles se reduce en una mezcla de óxidos azules de tungsteno y molibdeno. La coloración azul producida posee una absorción máxima próxima a los 750 nm. Es proporcional al nivel de compuestos fenólicos presentes en el vino. El método propuesto es una automatización directa del método manual.
7.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita utilizar 2 reactivos y realizar una medición a 750 nm.
7.3
Reactivos
Reactivo 1 Reactivo de Folin-Ciocalteu
Reactivo 2 Carbonato de sodio (CAS [497-19-8]) 20 g Agua desmineralizada hasta alcanzar 100 ml.
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7.4
Preparación de las muestras
Las muestras de vino o de mosto no se diluyen.
7.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 750 nm. La secuencia analítica es la siguiente: Ciclo Ciclo Ciclo Ciclo
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino o de mosto de 2 µl 1 (12 segundos): adición de 50 µl de reactivo 1 y 40 µl de agua desmineralizada. 25 (300 segundos): adición de 200 µl de reactivo 2 50 (600 segundos): lectura absorbancia Do a 750 nm
7.6
Calibrado
Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N° CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. Se utiliza un valor estándar obtenido por un vino dosificado por el método manual de referencia.
7.7
Lectura de los resultados
El valor del índice de Folin-Ciocalteu es directamente proporcional a la absorbancia medida DO.
7.8
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 4,5 Reproducibilidad interlaboratorio: 8,5
Dosificación del nitrógeno -aminado en los vinos y los mostos
8 8.1
Principio
Método químico. La cantidad de nitrógeno -aminico se determina por reacción con el o-ftaldialdehído. La intensidad de la absorbancia a 340 nm se compara con las obtenidas para patrones de concentraciones conocidas de isoleucina.
8.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita utilizar 2 reactivos y realizar una medición 340 nm.
8.3
Reactivos
Reactivo 1
NaOH (N°CAS [1310-73-2]) Ácido bórico (N° CAS[10043-35-3]) Agua desmineralizada hasta alcanzar
Reactivo 2
o-ftaldialdehído 99 % (N°CAS[643-79-8]) N-acetilŔcisteína (N°CAS [616-91-1]) Etanol (N° CAS [64-17-5]) al 1/2
8.4
3,837 g 8,468 g 1.000 ml
0,671 g 0,0816 g qsp 100 ml
Preparación de las muestras
Las muestras de vino o de mosto no se diluyen.
Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general
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8.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 340 nm. La secuencia analítica es la siguiente: Ciclo Ciclo Ciclo Ciclo Ciclo
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino de 5 µl 1 (12 segundos): adición de 200 µl de reactivo 1 24 (294 segundos): lectura absorbancia DO1 a 340 nm 25 (300 segundos): adición de 200 µl de reactivo 2 50 (600 segundos): lectura absorbancia DO2 a 340 nm
8.6
Calibrado
Se realiza en 6 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N° CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. Los otros 5 valores se obtienen con una gama de soluciones de Lisoleucina.
Solución madre de L-isoleucina
Soluciones de calibrado
L-isoleucina (N°CAS [73-32-5]) 0,936 g Agua desmineralizada hasta alcanzar 100 ml Agite bien hasta completar la disolución. Esta solución contiene 1 g de nitrógeno -aminado por litro. Es estable 3 meses.
Se preparan según el cuadro siguiente: Cantidad en ml de solución madre para 100 ml de agua desmineralizada Concentración de nitrógeno aminico en mg/l Vida útil: 3 meses
8.7
1
5
10
15
20
10
50
100
150
200
Lectura de los resultados
La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia DO 2 y la absorbancia de base DO 1. Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido de nitrógeno -aminado de la muestra utilizada. El resultado se expresa en mg de nitrógeno -aminado por litro.
9 9.1
Dosificación del nitrógeno amoniacal en los vinos y los mostos Principio
Método enzimático. En presencia de nicotinamida-adenosina-dinucleótido reducida (NADH), en una reacción catalizada por el glutamato deshidrogenasa (GLDH), los iones NH4+ y el 2- oxoglutarato forman L-glutamato. NH4+ + 2-oxoglutarato + NADH -> L-glutamato + NAD+ + H2O (en presencia de GLDH) La cantidad de NADH oxidada en NAD+ es proporcional a la cantidad de nitrógeno amoniacal presente.
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9.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita utilizar 2 reactivos y realizar una medición a 340 nm.
9.3
Reactivos
Los fabricantes suelen ofrecer los reactivos utilizados en forma de kit enzimático, lo que facilita su utilización por parte de los laboratorios. Ejemplo:
Reactivo 1 (30 ml) Tampón TRIS, 2-oxoglutarato pH 8
Reactivo 2 (6 ml) NADH (N° CAS [606-68-8])
14 mg
Reactivo 3 (0,6 ml) GLDH (N° CAS [9029-11-2])
9.4
550 U
Preparación de las muestras
Las muestras de vino o de mosto se diluyen 10 veces.
9.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 340 nm. La secuencia analítica es la siguiente: Ciclo Ciclo Ciclo Ciclo Ciclo
9.6
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino o de mosto de 5 µl 1 (12 segundos): adición de 100 µl de reactivo y 100µl de agua desmineralizada 24 (294 segundos): lectura absorbancia Do1 a 340 nm 25 (300 segundos): adición de 20 µl de reactivo 2 50 (600 segundos): lectura absorbancia Do2 a 340 nm
Calibrado
Se realiza en 6 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N° CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. Los otros 5 valores se obtienen con una gama de soluciones de sulfato de amonio.
Solución madre de sulfato de amonio
Soluciones de calibrado
(NH4)2SO4 (N°CAS [7783-20-2]) 4,8563 g Agua desmineralizada hasta alcanzar 100 ml Agite bien hasta completar la disolución. Esta solución contiene 12,5 g de nitrógeno amoniacal por litro. Es estable 3 meses.
Se preparan según el cuadro siguiente: Cantidad en ml de solución madre diluida al 1/10 para 100 ml de agua desmineralizada Concentración de nitrógeno amoniacal en mg.L-1 Vida útil: 3 meses
1
5
10
15
20
12,5
62,5
125
187,5
250
Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general
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9.7
Lectura de los resultados
La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia DO 2 y la absorbancia de base DO 1. Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido de nitrógeno amoniacal de la muestra utilizada. El resultado se expresa en mg de nitrógeno amoniacal por litro.
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