Curso 2009-2010

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Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 CURSO 2009-2010 1 Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 2 Práctica 1. El microscopio óptico. Objetivo Aprender a usar correctamente el microscopio óptico compuesto, familiarizándose con sus componentes y con diferentes métodos de medición, mediante el estudio cualitativo y cuantitativo de distintas preparaciones microscópicas. Introducción Desde su invención, el microscopio ha sido una herramienta útil en el desarrollo científico. Aunque las lentes de aumento han sido conocidas a lo largo de la historia, no fue hasta la llegada del moderno microscopio compuesto (s. XVII-XVIII) cuando este instrumento comenzó a ser aplicado al estudio biológico. Si para la mayoría de biólogos, el microscopio es una herramienta de trabajo importante, para los biólogos celulares es indispensable. El microscopio compuesto está formado por dos elementos; un sistema primario de lentes de aumento y un segundo sistema de lentes, similar a un telescopio. La luz es forzada a pasar a través de la muestra y es enfocada con los sistemas de lentes primarias y secundarias. Si reemplazados la fuente de luz por una fuente de electrones, el microscopio se convierte en un microscopio electrónico de transmisión. Si la luz es proyectada sobre la muestra y los sistemas de lentes captan la luz rebotada por la muestra el microscopio se convierte en un microscopio quirúrgico. Si son electrones los que son proyectados sobre la muestra, barriendo su superficie hablamos de un microscopio electrónico de barrido. La función de un microscopio es mejorar la resolución del ojo humano. El microscopio se usa para ampliar una imagen de un objeto de forma que podamos observar detalles que serían imposibles de observar a simple vista por el ojo humano. A causa de esta ampliación, la resolución se confunde a menudo con la magnificación o aumento que se refiere al tamaño de la imagen. En general, a mayor magnificación mayor resolución; aunque ésto no siempre es cierto. Hay limitaciones de carácter práctico en el diseño de las lentes que pueden resultar en un incremento de la magnificación sin incrementar la resolución. Considerando la figura 1.1, si una imagen de una célula es aumentada desde 10x a 45x, la imagen es más grande; pero no necesariamente más nítida. La imagen de la izquierda está aumentada sin mejorar la resolución, mientras que la imagen de la derecha tiene los mismos aumentos, pero la resolución ha mejorado. Cuando la imagen es aumentada 10 veces (desde 10x a 100x) es imposible usar la imagen de la izquierda; sin embargo, la imagen de la derecha nos da una información más detallada. Sin resolución la cantidad de detalles observables es fija y, a pesar de incrementar el tamaño de la imagen, no se observan más detalles. En este punto se alcanza el límite de resolución o poder de resolución de las lentes objetivo (u objetivo). Esta propiedad de los objetivos viene fijada por su diseño y construcción. Para cambiar la resolución, la única solución a menudo es usar objetivos diferentes. Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 3 La razón de la dicotomía entre magnificación y poder de resolución es la capacidad del ojo humano para diferenciar entre dos objetos próximos. Es necesario que dos objetos estén separados 0,1 mm, aproximadamente, cuando los mantenemos a 25 cm de los ojos para poder detectarlos como objetos diferentes. Si están a menos de 0,1 mm los percibimos como un único objeto. Si los dos objetos están separados 0,01 mm no podremos discriminarlos como dos objetos; a menos que aumentemos su imagen por 10x, con lo que hemos alterado eficazmente nuestra capacidad de resolución desde 0,1 mm a 0,01 mm o, inversamente, nuestro poder de resolución a aumentado en un factor de 10. Figura 1.1. Magnificación frente a resolución. Sólo magnificación Magnificación y resolución Así pues, una lente puede aumentar una imagen sin incrementar la resolución. Varios artefactos pueden ser inherentes al diseño de las lentes, provocando que el objeto aparezca con los límites desdibujados. Por lo que, incluso si aparecen separados 0,1 mm, los límites están tan desdibujados que perdemos la capacidad de diferenciar ambos objetos. Al igual que nos sucede al observar los optotipos oftalmológicos; podemos intuir las letras al incrementar el tamaño pero somos incapaces de identificarlas correctamente. Generalmente, se habla de la idoneidad de los objetivos microscópicos en términos de su magnificación o aumentos; mientras que el valor más importante es su resolución. Todos los Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 4 microscopios poseen un objetivo que puede aumentar por 40x el tamaño normal de una muestra; pero sólo un objetivo de buena calidad permite observar correctamente una muestra. Como se ha mencionado el valor de la resolución puede ser determinado de dos formas: 1. La distancia más pequeña entre dos puntos, que permite observarlos como distintos. Con esta medida, conforme disminuye la distancia aumenta la resolución. Hay una correlación inversa entre el límite de resolución (Formula de Abbe) y lo que de hecho se resuelve: Límite de resolución = (0,61·λ)/AN 2. Para cambiar esta fórmula a una correlación directa, se necesita sólo el reciproco del límite de resolución. El poder de resolución es inversamente reciproca al límite de resolución. Así, la resolución aumenta conforme aumenta la distancia. Consecuentemente, en la mayoría de microscopios hoy en día usan la resolución, en lugar del límite de resolución, para indicar la calidad de sus objetivos. Poder de resolución = AN/(0,61·λ) El poder de resolución de los objetivos es una característica de sus propiedades físicas y de la longitud de onda de la luz que pasa a través de sus lentes. Las propiedades físicas se resumen en un valor conocido como apertura numérica (AN), mientras que la longitud de onda es determinada por el color de la luz utilizada. Apertura numérica (AN) = n·sen θ Figura 1.2. Apertura numérica e índice de refracción. La apertura numérica de una lente depende de dos parámetros. Del ángulo de incidencia de la luz en la lente y del índice de refracción del material óptico de fabricación de la lente. La mitad del ángulo del cono de luz incidente se designa por el símbolo θ . La mitad del ángulo de incidencia de la luz se usa para calcular el ángulo de luz subtendida relativa al eje óptico del microscopio. El ángulo de incidencia de la luz y, Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 5 por tanto, θ pueden ser modificado por el condensador situado debajo de la platina. Si el condensador es móvil, el ángulo de incidencia puede variarse; así, conforme el condensador está más cerca del objeto más grande es el ángulo de incidencia de la luz. Tranduciéndose en una mejora de la resolución del microscopio. Figura 1.3. Apertura numérica y ángulo de incidencia de la luz. Las propiedades refractivas de un objetivo se resumen en un valor conocido como índice de refracción (IR ó n). El índice de refracción está en función de la distorsión de la luz al pasar del aire a la lente y viceversa. En un microscopio, el material de fabricación de la lente está especialmente formulado para incrementar su índice de refracción; sin embargo, una vez fabricado esta propiedad no puede ser cambiada. Aunque el medio alrededor del objetivo (lentes objetivo) si puede ser modificado; sustituyendo el aire entre el objetivo y el portaobjetos por aceite de inmersión, con índice de refracción superior al del aire. Considerando lo anterior, en la práctica la máxima resolución se puede aumentar optimizado de tres formas: a) El método más fácil es aumentar el ángulo de la luz incidente, alterando la posición y/o diseño del condensador, situado debajo de la platina. b) El índice de refracción puede ser mejorado mediante el uso de lentes especialmente fabricadas y/o mediante el control del medio a través del cual pasa la luz, usando aceite de inmersión en objetivos diseñados para este propósito. c) Disminuir la longitud de onda de la luz usada. Por razones prácticas, la modificación de la longitud de onda tiene mayor efecto sobre la resolución del microscopio que cambios en el ángulo de incidencia de la luz (θ) o el índice de refracción (n). En microscopía óptica de campo claro es conveniente trabajar en el rango de luz visible y la longitud de onda más corta del espectro de luz visible es el azul. Por lo que, los microscopios incorporan un filtro azul en su diseño; que se conoce como filtro de luz día, generalmente. Aberraciones Las distorsiones o aberraciones cromáticas y esféricas son inherentes al diseño de las lentes; debido a que las lentes son esféricas y proyectan una imagen esférica. Sin embargo, la teoría óptica se basa en imágenes planas. Además, las diferentes longitudes de onda de luz son refractadas distintamente; Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 6 la imagen esférica se distorsiona incluso en múltiples imágenes, debido a que cada longitud de onda forma una imagen separada. Una lente que está corregida para producir campos planos en vez de curvos se conoce como lente “plan”, mientras que una lente corregida para campo plano y aberración cromática se denomina lente “plan achromat”. Si la lente está corregida para aberraciones cromáticas para el rojo y azul, mientras que la corrección esférica es sólo para el verde, es una lente “achromat”. Angulo de incidencia Aunque el ángulo θ puede ser alterado, hay un límite teórico a este ángulo que permite a la luz pasar a la lente. Para cada objetivo hay una posición idónea del condensador; en la que se presenta la luz al objetivo con un ángulo apropiado, permitiendo un máximo de intensidad de luz; mientras mantiene θ tan grande como sea posible. En los microscopios buenos se puede ver el diafragma del condensador en el campo de luz y permiten un ajuste preciso (vertical y horizontal) del condensador a su posición ideal. El diafragma de iris se usa para corregir las aberraciones esféricas de las lentes y debe ser ajustado para cada objetivo. No deben ser usados para controlar la intensidad de luz a menos que la resolución no sea importante para el observador. Alineación Un uso correcto de un microscopio requiere que la óptica y la fuente de luz estén correctamente alineadas en el eje óptico. Todas las correcciones de aberraciones dependen de una adecuada alineación del microscopio. Generalmente, se usan dos técnicas para alinear el microscopio: a) La primera, y quizás la principal, se conoce como iluminación crítica. En este proceso una imagen de la fuente de luz (filamento de la lámpara) es proyectada en el plano del objeto, superponiéndose la imagen de la fuente de luz en el objeto. Sin embargo, tiene la desventaja de que exige el uso de una fuente de luz uniforme plana; lo que realmente no es posible con el filamento de una lámpara de tungsteno. b) El segundo procedimiento de alineación es conocido como iluminación Koehler y es el más común. En este procedimiento, una imagen del diafragma de campo se proyecta en el plano del objeto. Este procedimiento requiere un condensador de campo equipado con un diafragma de iris móvil (o centrable). Figura 1.4. Iluminación Koehler (August Koehler). Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 7 Ejercicio 1.1. El microscopio óptico de campo claro. Introducción El microscopio óptico compuesto es un instrumento que permite observar objetos no visibles a simple vista mediante un sistema óptico de lentes, que al ser atravesadas por la imagen de un objeto la amplifican. - Partes del microscopio En un microscopio óptico se distinguen una parte mecánica y otra óptica: a) La parte mecánica consta de las siguientes piezas: • Pie de soporte o estativo: alberga la fuente de iluminación. • Brazo: continuación del pie donde están insertadas el resto de piezas. • Tubo: cilindro hueco por donde circulan los rayos luminosos. En la parte inferior tiene un revolver con los sistemas de lentes, llamados objetivos, y en la superior porta la lente llamada ocular. • Platina: superficie horizontal para colocar la preparación microscópica. Esta se sujeta mediante una pinza, y puede moverse sobre la platina mediante un carro accionado por tornillos, en un plano inferior. Cualquier punto de la preparación puede ser fijado por el observador, tomando sus coordenadas con los nonios que porta el carro. La platina puede desplazarse en sentido vertical gracias a dos pares de tornillos situados a derecha e izquierda sobre el brazo: los tornillos macrométricos, que provocan desplazamientos rápidos, y los micrométricos, que mueven la platina muy lentamente. Mediante el desplazamiento de la platina se consigue el enfoque de la preparación. b) La parte óptica del microscopio óptico se compone de: • Ocular: sistema de lentes convergentes situado en la parte superior del tubo. • Objetivos: son tubos que albergan sistemas de lentes convergentes que proporcionan aumentos hasta 100x. Los objetivos están montados sobre una pieza base, llamada revolver, que permite intercambiarlos sobre la preparación. Cada objetivo lleva impresas sus características ópticas (aumentos, apertura numérica, etc.). • Condensador: es un sistema de lentes convergentes situado inmediatamente por debajo de la platina (en nuestro caso, es fijo y se desplaza junto con la platina). Su función es concentrar los rayos luminosos sobre la preparación. • Diafragma: palanca montada en la misma pieza del condensador, que regula la entrada de luz a éste y a la preparación. Al igual que en las cámaras fotográficas, un diafragma abierto Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 8 proporciona más luz, pero menor profundidad de campo (nitidez del enfoque a diferentes niveles horizontales de la preparación). • Fuente luminosa: es una lámpara de tungsteno, montada en el interior del pie. Figura 1.1.1. Componentes del microscopio óptico. - Principios de magnificación El principio de magnificación de un microscopio consiste en dos sistemas de lentes convexas que se combinan apropiadamente para magnificar las muestras. Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 9 Junto a la muestra AB, un sistema de lentes convexas (Lo), llamado objetivo, se usa para magnificar de 1 a 100 veces y crear una imagen real A’B’. Junto al ojo un sistema de lentes llamado ocular es usado para magnificar de 5 a 20 veces y crear una imagen virtual A’’B’’ a una distancia de visión nítida (aproximadamente a 250 mm del ojo). Es esta imagen aumentada A’’B’’ la que vemos durante la observación microscópica (Figura 1.1.2). Figura 1.1.2. Esquema óptico del microscopio. - Características ópticas del microscopio • Aumento total (M): Es el producto de los aumentos del objetivo por los del ocular. Puede obtenerse un rango de aumentos variable. Se calcula como: M = Mobjetivo x Mocular (x Mi) Donde: Mobjetivo = aumento del objetivo. Mocular = aumento de los oculares (indicado en los oculares). Mi = aumentos intermedios si corresponden (por defectos es 1) • Apertura numérica (AN): Determina la eficiencia del condensador y el objetivo. Cuanto mayor es la AN, las imágenes resultan de mayor calidad. Se calcula como: Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 10 Apertura numérica (AN) = n·sen θ Donde: n = índice de refracción del medio entre el objetivo y la preparación. θ = la mitad del ángulo máximo con el que penetra en el objetivo el cono de luz, desde un punto enfocado en el eje óptico. • Límite de resolución: Es la distancia mínima real que tiene que haber entre dos puntos para que el microscopio pueda mostrar dichos puntos como distintos y separados. Se calcula mediante la fórmula de Abbe: Límite de resolución = (0,61·λ)/AN Donde: λ = longitud de onda de la luz incidente (400 nm para la luz azul). AN = apertura numérica. El poder de resolución del ojo humano es aproximadamente 70 µm. • Distancia de trabajo: es el espacio entre el objetivo y la cara superior de la preparación, cuando la imagen está enfocada. Cuando mayor es el aumento del objetivo menor es la distancia de trabajo. • Profundidad de campo: es el espesor de muestra de la preparación microscópica que aparece nítido por encima y por debajo del plano de enfoque. Cuanto mayor es la AN del objetivo (o mayor es su aumento) menor es la profundidad de campo. Material • Microscopio binocular. • Portaobjetos con preparaciones microscópicas. Procedimiento 1. Comprobar la magnificación y la apertura numérica de los objetivos que están en el revolver del microscopio y la magnificación de las lentes oculares. Estos valores están impresos en cada uno de los objetivos (Figura 1.1.3) y de los oculares. En la tabla 1.1.1 anotar los valores de magnificación para cada objetivo y ocular y la AN para cada objetivo y el condensador. Calcular la magnificación total y el límite de resolución para cada objetivo y el poder de resolución máximo del microscopio usando aceite 11 Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 de inmersión (AN = 1,5). Asumir que la luz que atraviesa la muestra tiene una longitud de onda de 400 nm. Figura 1.1.3. Características de los objetivos. Tabla 1.1.1. Magnificación Apertura Numérica Aumento Total M = Mobjx Mocular (x Mi) Límite de Resolución (0,61xλ)/AN Magnificación de los oculares: Apertura numérica del condensador: Indica el objetivo de mayor AN: A.N. para una interfase de aire: 1,0 A.N para una interfase de aceite 1,5 Poder de resolución máximo del microscopio: AN/(0,61xλ) (µm) 2. Girar el revolver porta objetivos hasta que el objetivo de menor aumento esté en posición de observación. Coger una preparación microscópica, colocarla en la platina asegurándose que queda correctamente fijada, y con el cubreobjetos hacia arriba. Encender el microscopio ajustar la intensidad de luz con el potenciómetro a un nivel confortable para el observador. Nunca controlar la intensidad de luz con el condensador, asegurarse que el condensador esté abierto y en posición correcta. Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 12 3. Ajustar los oculares a la posición neutra de dioptrías (“0”). Ajustar los oculares a la distancia interpupilar y dioptrías del observador. La mayoría de microscopios están equipados con un tirador entre los oculares para su ajuste y sólo se requiere empujar o tirar directamente de los oculares juntos o individualmente. Mover los oculares (derecha e izquierda) hasta ver un campo de visión uniforme. 4. Enfocar el microscopio sobre cualquier objeto dentro del campo de visión: • Localizar un punto suficientemente contrastable en el centro del campo de visión y cerrar el ojo izquierdo. Usando los tornillos macro- y micrométrico enfocar hasta obtener una imagen nítida con el ojo derecho solamente. • Ahora cerrar el ojo derecho y ajustar el foco del ocular izquierdo girando el dioptrio situado en él. No reajustar el foco del ojo izquierdo con los enfoques macrométrico y micrométrico, usar el anillo de ajuste del ocular. 5. Seguidamente todos los usos del microscopio sólo requerirán los ajustes de enfoque macrométrico y micrométrico. Por supuesto, será necesario y se deberá comprobar y reajustar el microscopio al inicio de cada sesión. 6. Comenzar siempre enfocando la preparación por el objetivo de menor aumento (4x). Incluso si se va a usar el objetivo de mayor aumento (40x ó 100x). Es más eficaz comenzar con el objetivo de menor aumento e ir aumentando gradualmente la magnificación del objetivo, afinando el enfoque de la muestra con cada uno de ellos. Si los objetivos son parafocales, una preparación microscópica enfocada con un objetivo también estará, prácticamente, enfocada con el resto de objetivos y sólo se tendrá que corregir levemente el enfoque micrométrico. 7. Manipular el control macrométrico de enfoque hasta ver la preparación enfocada. Mover los tornillos de desplazamiento horizontal (XY) de la platina, hasta situar la preparación en la región de estudio deseada. Entonces, centrar la preparación y enfocar cuidadosamente, usando los tornillos de enfoque macrométrico y micrométrico, partiendo del objetivo de menor aumento hasta el de mayor aumento, realizando el estudio de la muestra con cada una de las magnificaciones. Usar el micrométrico para el ajuste fino y enfocar al máximo la imagen. 8. Durante el uso del microscopio, una mano debe de permanecer sobre el micrométrico reajustando el enfoque constantemente y la otra mano se usa para dirigir los movimientos de la platina. 9. Dibujar las imágenes que se observan con diferentes aumentos del microscopio, para cada preparación microscópica. Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 13 Ejercicio 1.2. Medida de las dimensiones en los ejes X, Y, y Z en microscopía. Introducción - Medidas en el eje Z El tornillo micrométrico de los microscopios está diseñado para que una vuelta completa de éste eleva o desciende la platina 0,2 mm. El tornillo micrométrico tiene una escala con 100 divisiones, que representan cada una de ellas 0,002 mm (2 µm) de desplazamiento vertical de la platina (eje Z). Esto nos permite hacer una lectura directa en la escala graduada del tornillo micrométrico del desplazamiento vertical realizado en el plano de enfoque de la preparación. Por lo que esta escala puede usarse para determinar el espesor de las muestras y estructuras microscópicas examinadas. - Medidas en los ejes X e Y Al colocar una preparación en el portaobjetos mecánico de la platina, el margen de desplazamiento es de 50 mm x 75 mm, aproximadamente; lo que nos permite realizar medidas comprendidas dentro de esos márgenes en muestras microscópicas. Para ello se usan las escalas ubicadas en el portaobjetos mecánico de la platina; así como, situar y localizar áreas de interés en la preparación mediante el sistema de coordenadas, que nos permite volver a un área de estudio o de interés determinada de forma precisa y reiterada. Los tornillos de control del portaobjetos mecánico, ubicados directamente a la derecha del portaobjetos y enfrente de los tornillos de enfoque, deben girarse para cambiar la posición visual de la muestra en el portaobjetos mecánico y en las escalas (de los ejes X e Y) situadas en este sistema. Las escalas ubicadas en la parte frontal posterior y lateral izquierda proporcionan respectivamente las lecturas para los ejes X e Y del plano horizontal de la preparación. La escala principal (“m”) está graduada en milímetros, y la escala vernier (“n”); corresponde a: 1 división de “n” = (9 divisiones de “m”)/10 En la figura 1.3.1 se muestra un ejemplo de uso de un nonio. El valor 0 de la escala vernier (n) se sitúa entre 12 y 13 de la escala principal (m); por lo que tomamos el menor valor de la escala principal (m), 12, como valor entero de la medición. Para calcular los decimales de la medida nos fijamos en la escala vernier (n) y comprobamos cual es la menor de sus divisiones que coincide con una división de la escala principal (m), en nuestro caso la división número 8 de la escala vernier es la primera en coincidir con una división de la escala principal (m), el 20. Por lo que consideramos 0,8 como el valor decimal de nuestra medida. Obteniéndose un valor total de 12,8 mm (12 + 0,8). 14 Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 Figura 1.3.1. Escala del portaobjetos mecánico. Escala principal “m”. Escala vernier “n”. Material • Microscopio. • Preparación microscópica. Procedimiento 1. Colocar la preparación en la platina del microscopio. 2. Enfocar correctamente el límite superior de la preparación. Anotar la marca de escala indicada en el tornillo micrométrico. Cuidadosamente, gira el tornillo de enfoque micrométrico y cuando el microscopio este justamente enfocado en el límite inferior de la preparación, anotar en la tabla 1.3.1 la lectura que se registra en la escala del tornillo micrométrico. Para realizar está operación resulta de gran utilidad centrarnos en estructuras tisulares que atraviesen completamente la muestra perpendicularmente al plano de sección. En nuestro caso, será de gran utilidad el sistema vascular puesto de manifiesto mediante el uso de colorantes perfundidos en el sistema vascular. Tabla 1.3.1. Posición Profundidad Límite superior: Posición media: Límite inferior: Grosor de la preparación (Límite superior- Límite inferior): (media ± σ) (µm) 3. Considerando los esquemas de la figura 1.3.2, localizar las regiones indicadas y con ayuda de la retícula y las escalas del portaobjetos mecánico de la platina acotar las muestras calculando el tamaño de cada uno de las distancias que se indican en dicha figura. Anotar los resultados en la tabla 1.3.2. 15 Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 Tomar como referencia un extremo del segmento a medir con ayuda de la retícula anotar el valor indicado en la correspondiente escala (eje X o Y) y recorrer en dirección X o Y, según corresponda, la preparación hasta el otro extremo del segmento a medir, anotar el valor indicado en la escala. La sustracción de los dos valores obtenidos será la longitud de dicho segmento y, por tanto, el tamaño de esa región de la preparación. Muy importante: Comprobar que al desplazarse en dirección X no se altera la posición en el eje Y, y viceversa. De lo contrario, la medida sería errónea. Figura 1.3.2. Secciones de cerebro. A) Sección sagital. B) Sección coronal. A) c d b e a f B) g h l k i j 16 Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 Tabla 1.3.2. Segmento Medida (± σ) (mm) Segmento A g B h C i D j E k F l Medida (± σ) (mm)