Pruebas De Compatibilidad Cruzada Para Trasplantes Xm

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n alm, 556. m jitve o bo. Descripción del producto: pruebas de compatibilidad cruzada para trasplantes XM-ONE® (4 pruebas). Un equipo que consta de tubos CPT Vacutainer® para la preparación de células mononucleares de la sangre periférica (CMSP), microesferas magnéticas para aislar las células precursoras endoteliales que expresan marcadores endoteliales y de monocitos de estas CMSP y reactivos secundarios para detectar anticuerpos séricos que puedan unirse a las células aisladas. El equipo también contiene anticuerpos frente a CD3 y CD19 que pueden utilizarse para realizar pruebas de compatibilidad cruzada de linfocitos. Componentes del producto: el equipo está compuesto por 16 tubos CPT Vacutainer®, 4 tubos de vidrio siliconados, 4 tubos de microesferas magnéticas, 1 vial de anticuerpos anti-CD3, 1 vial de anticuerpos antiCD19 y viales de anti-IgG y anti-IgM. Uso previsto: XM-ONE® es un equipo de diagnóstico in vitro que se emplea para aislar células precursoras endoteliales que expresan marcadores endoteliales y de monocitos y para preparar muestras para análisis de anticuerpos de IgM e IgG específicos para estas células. El equipo también incluye reactivos que permiten realizar pruebas opcionales de compatibilidad cruzada de linfocitos junto con el ensayo. Resumen, explicación y principios: el análisis de los anticuerpos específicos para las células que expresan marcadores endoteliales y de monocitos permite realizar pruebas de compatibilidad cruzada para trasplantes mediante la detección de anticuerpos que actúan contra los antígenos que se expresan en estas células. XM-ONE® ofrece reactivos optimizados para la detección por citometría de flujo de anticuerpos que pueden unirse a las células aisladas. Los reactivos secundarios se unen al FITC, lo que puede detectarse por el canal FL1. El procedimiento de prueba es parecido al de las pruebas de compatibilidad cruzada por citometría de flujo de linfocitos. Las células endoteliales precursoras se aíslan, se incuban con suero y se tiñen con anticuerpos secundarios anti-IgM y anti-IgG. Las células que muestran un resultado positivo presentan un aumento de FL1 en comparación con las células incubadas con suero de control negativo. Opcionalmente, el usuario también puede llevar a cabo pruebas de compatibilidad cruzada de linfocitos T y B utilizando los anticuerpos CD3 PE y CD19 PerCP incluidos en el equipo. Precaución: para el uso en diagnóstico in vitro. Este producto deben usarlo únicamente los profesionales sanitarios. Además, el responsable de analizar el resultado debe estar familiarizado con la citometría de flujo. Una vez usados, todos los materiales deberán eliminarse como desechos con riesgo biológico. Todas las muestras biológicas deben tratarse como material potencialmente infeccioso. Conservación: las microesferas magnéticas y los anticuerpos secundarios deberán conservarse siempre a una temperatura entre 2 ºC y 8 ºC. Los tubos CPT Vacutainer® y los tubos de vidrio siliconados pueden almacenarse a una temperatura entre 18 ºC y 25 ºC. Los tubos CPT Vacutainer® deberán estar a una temperatura entre 18 ºC y 25 ºC cuando se usen. Todos los reactivos del equipo deberán mantenerse alejados de la luz solar directa. La fecha de caducidad aparece en la etiqueta del equipo. Todos los componentes del equipo deberán usarse antes de esa fecha. Los anticuerpos secundarios pueden utilizarse, como máximo, hasta dos meses después de su apertura. Contenidos y reactivos del equipo: este equipo contiene componentes para 4 pruebas: 4 viales de suspensión de microesferas, 4 tubos de vidrio siliconados, 1 vial de 400 μl de anti-IgM, 1 vial de 400 μl de anti-IgG, 1 vial de 800 μl de anti-CD3, 1 vial de 800 μl de anti-CD19, 16 tubos CPT de heparina BD Vacutainer® y 1 manual de instrucciones de uso. Conservación: consulte la etiqueta de la bandeja interior, los tubos CPT y las instrucciones de uso, más abajo. Requisitos de instrumental/equipo: A) Citometría de flujo. B) Imán para aislar células endoteliales precursoras. Utilice un imán compatible con los tubos de vidrio siliconados que se incluyen. No utilice imanes que requieran columnas o componentes adicionales. Con el equipo XM-ONE® se han utilizado imanes estándar para separar células de los fabricantes siguientes: Invitrogen (antigua marca comercial: Dynal), StemCell Technologies Inc. También pueden utilizarse imanes de otros fabricantes, aunque aún no se ha determinado su rendimiento con el equipo. C) También se requieren otros instrumentos que se encuentran habitualmente en laboratorios, como pipetas, baño de hielo, neveras, centrifugador refrigerado con rotor oscilante y un balancín que alcance de 5 a 10 inclinaciones por minuto. ABX100-5 Ver. 1 33 ES uppan, Pruebas de compatibilidad cruzada para trasplantes XM-ONE® – Instrucciones de empleo Los siguientes reactivos son necesarios pero no se incluyen en el equipo: A) Sueros de control negativo (suero que no contiene anticuerpos que se unen a las células aisladas). B) Sueros de control positivo (suero que se une a las células aisladas). C) Solución amortiguadora de lavado: solución amortiguadora de fosfatos (PBS) con pH 7,4 sin Ca2+ y Mg2+, ambas a una temperatura entre 18 ºC y 25 °C y entre 0 ºC y 4 ºC. Opcional: 0,01% de BSA sin IgG como aditivo para la solución amortiguadora de lavado. Si añade BSA, asegúrese de que su mezcla no provoque una tinción no definida en las células aisladas de la citometría de flujo. Si se realizan pruebas de compatibilidad cruzada de linfocitos T y B en un ensayo XM-ONE, recomendamos añadir BSA para aumentar la viabilidad de los linfocitos B en particular. Recogida y preparación de muestras A) El suero de prueba puede ser fresco o descongelado. Sin embargo, los agregados deben eliminarse del suero de prueba por centrifugación (8.000 – 10.000 xg durante 10 minutos) o filtración (0,2 µm) antes de realizar las pruebas. Debe evitarse repetir el proceso de congelación-descongelación, ya que puede disminuir los títulos de anticuerpos del suero. Observe que el ensayo detecta los anticuerpos en el suero de prueba y que estos anticuerpos pueden verse afectados por las condiciones de conservación, por el manejo, etc. El suero de prueba no debe inactivarse térmicamente. ES Instrucciones de funcionamiento 1) Obtenga sangre del candidato a donante para la preparación de células en 4 de los tubos CPT Vacutainer®. Los tubos CPT Vacutainer® deberán estar entre 18 ºC y 25 ºC cuando se usen. Como alternativa, si extrae sangre en tubos que no sean CPT, transfiera la sangre a los tubos CPT y proceda según las instrucciones. Aviso importante: no utilice tubos EDTA para la extracción de sangre, ya que el EDTA interfiere con el aislamiento de las células. 2) Inmediatamente después de la extracción, invierta con cuidado los tubos CPT llenos hasta 180º y vuelva a la posición inicial, de 8 a 10 veces. Recomendamos procesar la sangre extraída lo antes posible. 3) Centrifugue los tubos en una centrifugadora horizontal (cabezal de mecedora), con freno activado, entre 1.500 y 1.800 xg y a una temperatura entre 18 ºC y 25 ºC durante 15 minutos. 4) Una capa blanca de CMSP deberá estar visible encima de la barrera de gel estable. Invierta con cuidado el tubo 3 veces para suspender las células en el plasma. La barrera de gel permanecerá intacta. 5) Abra los tubos CPT y transfiera la suspensión de células de los 4 tubos a un tubo vacío de 50 ml. Llene el resto del tubo con solución amortiguadora de lavado, a una temperatura entre 18 ºC y 25 ºC. 6) Centrifugue las células a 450 xg a una temperatura entre 18 ºC y 25 ºC para que formen microesferas y resuspéndalas en 1 ml de solución amortiguadora de lavado a una temperatura entre 18 ºC y 25 ºC. Transfiera las células resuspendidas a un tubo de vidrio siliconado incluido en el equipo. 7) Añada 0,5 ml de solución amortiguadora de lavado, a una temperatura entre 18 ºC y 25 ºC, en un tubo de microesferas en suspensión (tapón verde) y resuspenda las partículas magnéticas. Transfiera las partículas magnéticas al tubo siliconado que contiene las CMSP. 8) Incube las CMSP y la mezcla de microesferas magnéticas en hielo durante 30 minutos con una inclinación suave (de 5 a 10 inclinaciones/minuto). 9) Añada 4 ml de solución amortiguadora de lavado fría (0-4 ºC) y aísle las células aplicando el tubo al imán durante 10 minutos. La fuerza del campo magnético puede influir en el tiempo necesario para la separación magnética. A continuación, extraiga con la pipeta las células no aisladas, introdúzcalas en otro tubo y sumérjalo en hielo. No deseche ninguna célula antes de confirmar que las células se hayan aislado satisfactoriamente. Tenga en cuenta que las células no aisladas pueden utilizarse para realizar pruebas de compatibilidad cruzada de linfocitos T y B si los ensayos no se realizan como parte del ensayo XM-ONE. 10) Aparte el tubo del imán y resuspenda las células aisladas en solución amortiguadora de lavado a 0-4 ºC. Distribuya las células aisladas a partes iguales entre los tubos de citometría de flujo que desee utilizar. Debe haber entre 200.000 y 1 millón de células por tubo. Si las pruebas opcionales de compatibilidad cruzada de linfocitos T y B deben realizarse en el mismo tubo, en cada tubo debe haber entre 500.000 y 1 millón de células para recuperar una cantidad estadísticamente significativa de linfocitos B. 34 ABX100-5 Ver. 1 Por lo Añada 450 xg secante microe 15 + 15 Opcion — que 1:5 No — 11) De el m ens 12) 13) 14) 15) 16) Si dese a2+ e NE, rse µm) ya que pos Planifique la división de las células para incubarlas con: — suero de control positivo — suero de control negativo — suero del receptor Por lo tanto, para la detección de IgG e IgM se necesitará un mínimo de 6 tubos. Añada 4 ml de solución amortiguadora de lavado a 0-4 ºC por cada tubo FACS. Centrifugue las células a 450 xg (preferentemente a 4-10 ºC), deseche el sobrenadante con cuidado y decante el tubo contra un papel secante para recoger la última gota de solución amortiguadora de lavado. Añada 50 µl de cada suero a las microesferas de células (los sueros de control no se incluyen en el equipo). Mézclelo e incúbelo durante 15 + 15 minutos a temperatura ambiente y mézclelo suavemente tras los primeros 15 minutos. Opcional: — Debido al riesgo de efectos de prozona, que pueden causar resultados falsamente negativos en sueros que contienen títulos altos de anticuerpos, recomendamos procesar los sueros desconocidos diluidos a 1:50 en paralelo con los sueros sin diluir. Nota: las diluciones deben realizarse en suero de control negativo. — Las pruebas autólogas de anticuerpos también pueden realizarse con XM-ONE. omo 11) Lave las células tres veces con 4 ml de solución amortiguadora de lavado a 18-25 ºC. e Después de este paso puede optar por incluir pruebas de compatibilidad cruzada de linfocitos T y/o B en el mismo tubo. Si deben llevarse a cabo pruebas de compatibilidad cruzada de linfocitos, incluya en el ensayo el paso 13 opcional. 0º y tes vado, ntacta. . Llene entre el un nsfiera a tubo al o para úzcalas as se e para mo 12) Para detectar la IgM unida a las células aisladas: añada 10 µl de anticuerpos secundarios específicos para IgM (conjugados con FITC, tapón amarillo) por tubo. Para la detección de IgG unida a las células aisladas: añada 10 µl de anticuerpos secundarios específicos para IgG (conjugados con FITC, tapón rojo) por tubo. No olvide añadir los anticuerpos secundarios a las muestras para los controles positivos y negativos. 13) Opcional: si deben realizarse pruebas de compatibilidad cruzada de linfocitos T y B en el mismo tubo que el XM-ONE, añada 10 μl de anti-CD3 (PE conjugado, tapón azul) y/o 10 μl de anti-CD19 (PerCP conjugado, tapón violeta) en cada tubo. 14) Incúbelo en hielo o a 4 ºC durante 20 minutos en un lugar oscuro. 15) Lave las células dos veces con solución amortiguadora de lavado a 0-4 ºC, centrifugándolas a 450 xg (preferiblemente a 4-10 ºC). Resuspenda las células en 0,2 ml de PBS. Si es necesario, este volumen se puede aumentar o disminuir según los procedimientos de laboratorio para citometría de flujo. Conserve las muestras en un lugar oscuro en hielo o a 4 ºC. Recomendamos analizar las muestras lo antes posible tras el procedimiento de tinción para evitar que la conservación prolongada disminuya la viabilidad de las células aisladas. 16) Analícelo por citometría de flujo. Los ajustes, entradas y cortes que deben utilizarse para la citometría de flujo están determinados por el instrumento utilizado y son responsabilidad del usuario. Si se utilizan los anticuerpos opcionales CD3 y CD19, tenga en cuenta que deberán realizarse ajustes para poder analizar todas las células a la vez y que deberá compensar correctamente el FITC, PE y PerCP. Si desea obtener más información, entre en http://www.absorber.se/products.asp oa e ales o debe cativa ABX100-5 Ver. 1 35 ES s). Bibliografía 1) Sumitran-Holgersson, S. and Holgersson, J. Curr. Opin. Organ Transplant. 2006, 11: 425-432. 2) Vermehren, D. and Sumitran-Holgersson, S. Transplantation 2002: 72, 1479-1486 Sumitran-Karuppan, S., Tydén, G., Reinholt, F., Berg, U. and Möller, E. Transplant Immunol. 1997, 5:321-327. 3) Lucchiari, N., Panajotopoulos, N., Xu, C., Rodrigues, H., Estevam, L., Kalil, J. And Glotz, G.;Human Immunology 2000: 61, 518-527 4) Rodríguez PC, Arroyave IH, Mejía G, García LF. 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Descripción de símbolos n Número de catálogo Código de lote Fecha de caducidad Contenido suficiente para ensayos Consulte las instrucciones de uso Límite de temperatura Fabricante Producto sanitario para diagnóstico in vitro Manténgase alejado de la luz solar Información y correspondencia a AbSorber AB, Drottninggatan 33, SE-103 95 Estocolmo, Suecia www.absorber.se XM-O Produ Vacuta för iso PBMC cellern med ly Produ magne Avsedd prekur specifi att vid Samm endote genom optime cellern den so serum FL1-öv utföra Försik sjukvå flödesc biologi Förvar och 8 ° 18–25 skall sk före de öppnat Kitinn 4 siliko 800 μl inre trå ES Instru A) B) C) Nödvä A) B) C) 36 ABX100-5 Ver. 1