La Reaccion En Cadena De Polimerasa (pcr

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190 Dovc LA REACCION EN CADENA DE POLIMERASA (PCR, Polimerase Chain Reaction) APLICADA EN PROGRAMAS DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES P. Dovc Introducción En los programas de transferencia de embriones es deseable contar, antes de la transferencia, con información confiable sobre el genotipo del embrión. Sobre todo sería importante diagnosticar su sexo. De la misma forma sería interesante obtener información sobre la eventual presencia de predisposiciones a enfermedades hereditarias y la constitución génica en algunos loci, importantes para las características de valor productivo. La reacción en cadena de polimerasa brinda la oportunidad de amplificar específicamente un reducido número de copias de ADN genómico para fines analíticos. La ejecución de estos tests, aunque sensible a perturbaciones, es relativamente simple y puede brindar la información deseada al cabo de pocas horas. Por ello el diagnóstico génico mediante la reacción PCR es un método de elección para los programas de TE. La historia de la biología molecular muestra que a menudo el desarrollo y la puesta a punto de nuevas técnicas tienen una marcada influencia sobre el modus procedere para resolver problemas básicos y aplicativos. De esta forma la reacción de PCR marcó un importante cambio en la estrategia para resolver problemas en un amplio campo de la biología molecular. La reacción PCR en la forma actual fue establecida por MULLIS y FALOONA en 1987 y fue intensamente automatizada mediante la aplicación de modernos instrumentos. Por un lado la reacción PCR puede reemplazar parcialmente algunos métodos antiguos y complicados (determinación del genotipo de loci individuales). Por otro lado permite el desarrollo de nuevas estrategias (p.e. "gen linkage", análisis a nivel molecular, caracterización del genotipo de determinadas células en forma individual). La reacción PCR representa una eficiente técnica para la replicación de segmentos específicos de ADN in vitro e impulsa el desarrollo del área de análisis de ADN y ARN. La idéntica duplicación del material hereditario y su transmisión a la próxima generación es una característica de todo ser vivo. La reproducción de la masa hereditaria (replicación del ADN) sucede en forma semi conservadora: en la doble hélice de ADN una es la cadena original, mientras que la otra es su homólogo sintetizado posteriormente. In vivo la replicación de ADN es un proceso complejo que requiere la acción coordinada de una gran cantidad de enzimas. En primer lugar las largas moléculas de ADN genómico deben ser desespiralizadas, estabilizadas en ese estado, replicadas y luego la nueva cadena doble, recién sintetizada, debe ser transformada nuevamente en la cadena de doble hélice original. Estos procesos ocurren a una velocidad de unas miles de bases por minuto con una frecuencia de error de 1x10-9. Las polimerasas de ADN juegan un rol preponderante en la replicación in vivo de ADN como matriz (template), un final 3'OH de un fragmento corto de una cadena doble de ADN libre como oligonucleótido iniciador (primer) y nucleótidos trifosfato desoxigenados (dNTPD, N corresponde a adenosina, citosina, guanidina o timidina) como bases para la cadena complementaria. Normalmente las polimerasas de ADN necesitan para su actividad, la presencia de iones metálicos como cofactores. Estos componentes -matriz, oligonucleótido iniciador con final 3'OH libre, dNTPs y polimerasasrepresentan también los elementos para la replicación de ADN in vitro. En la concepción de la reacción PCR se unieron varios pasos de la síntesis, logrando una amplificación específica de una región limitada por oligonucleótidos iniciadores (MULLIS y col., 1987). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Reacción en cadena de polimerasa 191 Principios de la reacción PCR La idea de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se basa en la repetida síntesis de una región de ADN que es limitada por dos moléculas iniciadoras. Para la selección y la síntesis del iniciador es necesario tener por lo menos la información sobre la secuencia en los extremos del ADN que se desean amplificar. Esto posibilita la ubicación de dos oligoelementos iniciadores complementarios a la cadena matriz, de tal manera que demarcan la secuencia blanco. La matriz de ADN es desnaturalizada en primer lugar mediante calentamiento de 94 a 96o C, la reasociación se impide luego por medio de un enfriamiento rápido. En presencia de iniciadores adecuados, dNTPs y polimerasas de ADN, se logra un acoplamiento de las moléculas iniciadoras a la parte homóloga de la matriz (primer annealing), posteriormente la polimerasa puede sintetizar la segunda cadena. De esta manera se obtienen dos cadenas dobles a partir de una. Estas pueden ser a continuación utilizadas nuevamente como matriz. Una repetida desnaturalización por medio de calor conduce a la liberación esta vez de cuatro matrices que pueden ser complementadas a continuación formando cuatro cadenas dobles de ADN. De esta forma se puede duplicar el número de copias de cada ciclo y después de n ciclos concentrar una región específica a un valor 2n. Es necesario destacar que durante la amplificación se forman dos distintas amplificaciones: cortas, limitadas en ambos extremos por la del iniciador y copias largas que sobrepasan la secuencia homóloga al iniciador en el final 3'OH. La amplificación de los fragmentos cortos sucede en forma exponencial, mientras que el incremento de las copias largas se manifiesta en forma lineal. Después de n ciclos el número de fragmentos cortos aumentó a 2n (n + 1). Una sola molécula puede ser modificada de esta manera en 20 ciclos por el millonésimo factor (220). La idea ya fue descripta en los años '70 (KLEPPE y col., 1971). En un comienzo se utilizó una polimerasa de ADN termolábil (fragmento Klenow de la polimerasa I de E. Coli). Luego de cada desnaturalización fue necesario agregar la polimerasa nuevamente, lo que complicaba y encarecía el procedimiento. La aplicación de la polimerasa de ADN termoestable de thermus aquaticus, cuya actividad se mantiene durante un alto número de ciclos, permite incorporar la polimerasa una sola vez al comienzo de la reacción. Diferentes pasos de la reacción PCR (desnaturalización, alineamiento del iniciador-primer annealing- y extensión del iniciador) requieren cambios de temperatura relativamente rápidos. Una solución sencilla es la instalación de 3 baños María. Uno con temperatura de desnaturalización (94-96o C), el segundo con la temperatura adecuada para el alineamiento del iniciador a la matriz (primer annealing, 50-70oC) y el tercero con la temperatura apta para la síntesis (72o C). Dado que es muy trabajoso cambiar manualmente los tubos de ensayo se recurrió rápidamente a la ayuda de brazos robots. El siguiente paso fue el desarrollo de los hoy muy comunes termocicladores, capaces de repetir cíclicamente los cambios de temperatura deseados gracias a microprocesadores. Los programas de estos aparatos permiten variar sus funciones. Esto significa que es posible prolongar el tiempo de desnaturalización en el primer ciclo, extender la duración de la fase de síntesis en el ciclo final y enfriar el tubo de ensayo a 4o y hasta 8o C al concluir la reacción. La mayoría de las máquinas pueden ser programadas libremente siendo posible le elección de temperaturas dentro del margen de 50-96o C. El cambio de temperatura al calentar o enfriar sucede a una velocidad de 1 a 2oC/min-1. Según el equipamiento técnico se distinguen termocicladores con un bloque metálico termorregulado para los tubos y otros con baño fluyente. Componentes de la reacción Los componentes de la reacción PCR pueden ser comprados en forma de set completo ("gen-Amp.Kit", Perkn-Elmer/Cetus). Diversas firmas ofrecen también los componentes en forma separada. El empleo de un set es recomendable para el principiante y para los laboratorios que tienen dificultades en conseguir los reactivos de alta calidad. La combinación individual de los componentes para la reacción Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 192 Dovc PCR requiere la adquisición de polimerasa ADN, dNTPs, MgCl2, KCl, Tris, detergente no iónico, gelatina o albúmina de suero de vaca, iniciadores y matriz de ADN. En la mayoría de los casos se utiliza la polimerasa de ADN termoestable, aislada de la bacteria termófila thermus aquaticus (polimerasa ADN-Taq). La termoestabilidad y la alta temperatura óptima hacen que esta enzima sea de elección para múltiples aplicaciones. La misma es ofrecida ya por varias firmas. Aparte de la polimerasa ADN-Taq hay otras polimerasas termoestables en el mercado (polimerasa ADN-Tth de thermus thermophilus, polimerasa ADN-Bst de Bacillus stereo-thermophilus, polimerasa ADN-Vent der thermococcus litoralis). La mayoría de las polimerasas de ADN termoestables tienen una actividad óptima a temperaturas entre 70-78o C y sintetizan la cadena homóloga a una velocidad de más de 1000 bases por minuto. Para esa actividad óptima se requiere un pH de 8,2 a 9,5 en 10mM de solución tampón Tris. Los nucleótidos trifosfáticos desoxigenados (dNTP) son ofrecidos liofilizados o en soluciones acuosas de 100 mM. Es conveniente preparar soluciones de 2mM de cada dNTP y congelarlas en pequeñas porciones (100 a 200 µl). Bajo estas condiciones son estables durante varias semanas. Las soluciones tampón son usualmente producidas y almacenadas en forma décupla concentrada. La composición común es de 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% gelatina, 0,01% NPO4 y 0,01 Tween 20 (SAIKI y col., 1988). Detergentes no iónicos pueden ser reemplazados por Tritón x-100 aunque la presencia de un detergente es decisiva para el procesamiento de la enzima. Se debe recordar que altas concentraciones de dNTPs forman complejos MgCl2, lo que reduce la disponibilidad del mismo. Por ello es necesario aumentar la concentración de MgCl2 en dicho caso. Los oligonucleótidos iniciadores sintéticos con 18 a 30 nucleótidos mostraron ser adecuados para la amplia gama de aplicaciones. Iniciadores cortos de 18 nucleótidos son suficientes para la ampificaciones de matriz-ADN poco complejas (p.e. plasmidios). Los iniciadores universales con lectura hacia adelante y atrás (Forward y Reverse-Primer) son adecuados para la amplificación de sectores clonados. A menudo la calidad y pureza de los iniciadores sintéticos es satisfactoria y pueden ser utilizados sin purificación accesoria. En caso contrario se ofrece la purificación HPLC en una columna cromatográfica o la limpieza a través de poliacrilamida. Al diseñar un iniciador se debe tener en cuenta que los iniciadores tengan semejante cantidad de guanidina y citosina, que no formen estructuras secundarias estables y que tengan poca homología entre sí. Sobre todo es importante que no exista homología en la región 3'- entre los iniciadores. Ya se ofrecen a la venta programas de computación que facilitan decisivamente la selección de los iniciadores. Como matriz (template) puede ser utilizado ADN del más variado origen. Para una amplificación exitosa es de decisiva importancia que la preparación del ADN no contenga impurezas que puedan interferir la misma negativamente. Sobre todo la presencia de fenol, detergentes y EDTA tiene un efecto perturbador. Dado que el largo de las amplificaciones excede en raros casos 1-2 Kb, el ADN-matriz no requiere tener alto peso molecular. Sectores cortos pueden ser amplificados exitosa-mente aún a partir de matrices ADN degradadas como por ejemplo en material arqueológico (PÄÄBO y col., 1988). Para la amplificación es importante una buena desnaturalización de la matriz-ADN. Se recomienda una desnaturalización de por lo menos 5 min antes de la aplicación de la enzima. Las condiciones de reacción dependen sobre todo de la temperatura de fusión del iniciador (temperatura de alineamiento, "annealing temperature") y del largo de la amplificación (tiempo de síntesis). Es necesario establecer experimentalmente el tiempo de reacción óptima para cada par de iniciadores. El volumen de reacción varía de 25 a 100µl dependiendo de la cantidad de amplificaciones que se requiere para los estudios posteriores. Por razones económicas es propicio reducir al mínimo el volumen de reacción en análisis de rutina. La concentración del iniciador oscila entre 25 y 100 pmol. Para la mayoría de las amplificaciones son suficientes 25 a 30 ciclos de amplificación. Se requieren más ciclos si la matriz-ADN que se quiere copiar se presenta en un reducido número de muestras (p. e. ADN de células aisladas). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Reacción en cadena de polimerasa 193 Análisis de los productos de la reacción PCR La concentración específica de la secuencia entre los iniciadores permite amplificar una cantidad suficiente de ADN para un análisis electroforético a partir de un grupo pequeño de copias de la matrizADN. En la mayoría de los casos es posible separar las amplificaciones en gel de agarosa de 0,8 a 2,0% y observarlas bajo luz ultravioleta después de una coloración con etidio bromado (Ethidium Bromid). Si se trabaja con fragmentos muy cortos, que deben ser divididos con enzimas de restricción después de la amplificación (fragmentos más cortos que 50 pB), algunas veces es necesario utilizar geles de poliacrilamida (PAA) para alcanzar una separación suficiente. Para los geles PAA se puede utilizar la coloración con etidio bromado o la coloración con plata. Esta última, a pesar de ser más complicada, es más apropiada para fragmentos muy cortos y cantidades pequeñas de ADN debido a su sensibilidad. Particularmente exigente es la separación electroforética de las amplificaciones de las llamadas regiones "microsatélites". Microsatélites son regiones repetidas en el genoma que se componen de muchas copias de una secuencia corta (por lo general son dinucleótidos). Estas regiones se diferencian a menudo en el largo solamente por dos nucleótidos. Para el análisis de dichas amplificaciones es importante un sistema electroforético de alto poder resolutivo. En estos casos se utilizan productos de la reacción PCR marcados radioactivamante o de otra manera. Estos son separados sobre geles finos PAA (estos geles se utilizan también para determinar la secuencia del ADN). Para detectar mutaciones puntuales se aprovecha la distinta forma de fusión de las amplificaciones que surgen a partir de las mutaciones. Para ese fin se preparan geles con gradientes lineares del desnaturalizante ("Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - DGGE, MYERS y col., 1987). En la migración a través del gradiente las moléculas de ADN se desnaturalizan en forma paulatina en función del número de dominios de fusión (región topográfica de la hélice de ADN). Esto determina el diferente modo de fluir. En este sistema no es necesario buscar lugares de restricción polimorfos para la separación específica del alelo. Una sola mutación puntual altera la temperatura de fusión de un dominio determinado (25 a varios cientos de nucleótidos) hasta 1,5o C. La migración de los fragmentos parcialmente desnaturalizados en el DGGE es más lenta que el flujo de los fragmentos correspondientes no desnaturalizados. La separación electroforética de los fragmentos de cadenas simples en geles-PAA nativos brinda un método alternativo para la detección de mutaciones puntuales en amplificaciones obtenidas mediante la reacción PCR. Las amplificaciones desnaturalizadas con anticipación forman estructuras secundarias en el gel PAA nativo dependientes de la secuencia. Las diferentes mutaciones puntuales influyen de manera difícilmente pronosticable sobre las estructuras secundarias de los fragmentos. No obstante lo hacen de forma tan marcada que es posible identificar mutantes que difieren por una mutación puntual debido a la diferente movilidad entre dos amplificaciones. Reacción PCR múltiple (PCR Multiplex) Junto con la amplificación específica de una región flanqueada por un par de iniciadores que pertenecen a una matriz compleja, la elección de otros pares de iniciadores posibilita la amplificación de varios fragmentos específicos de ADN en una sola reacción PCR. Para ello se deben cumplir algunas condiciones: cada par de iniciadores debe responder a la exigencia general para los iniciadores descripta en el punto "componentes para la reacción", no debe existir alta homología entre los iniciadores de una reacción y finalmente todos deben tener similar temperatura de fusión (Tm). Reacciones PCR múltiples son reacciones concebidas con el fin de estudiar simultáneamente varias localizaciones (loci) del genotipo (p.e. diagnóstico génico de enfermedades hereditarias con un amplio espectro de diferentes mutaciones, exámenes de identidad, etc.). A veces se utiliza la reacción PCR Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 194 Dovc múltiple como reacción interna de control para comprobar la región haploide existente en el genoma (región específica para el cromosoma Y, PEURA y col., 1991). La importancia de la reacción PCR múltiple como reacción de control es cuestionable sobre todo en los casos en los cuales se amplifican muy pocas matrices y especialmente se supone que las amplificaciones en las diferentes localizaciones son sucesos independientes. Tipificación del genotipo de espermatozoides (Single Sperm Typing) La construcción de mapas génicos exigió hasta el momento el apareamiento selectivo, el estudio de la descendencia o la determinación de las combinaciones génicas en base a los datos obtenidos por el estudio del pedigree. La primera posibilidad fue aprovechada a menudo para animales. Para el estudio del genotipo humano sólo es considerada la segunda estrategia. La introducción de los marcadores RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) posibilitó dividir el genoma humano en sectores mas o menos regulares de 10 cM. El análisis del pedigree permite determinar las distancias génicas en sectores de 1 cM (en el hombre cerca de 100 kb) en forma estadísticamente asegurada. Para la estimación de distancias más cortas el número de datos requeridos sería demasiado grande por lo que este método parece ser inadecuado para estos objetivos. A partir de la introducción de la reacción PCR es posible amplificar el ADN de una célula en lugares específicos en forma tan abundante que las ampliaciones obtenidas son suficientes para fines analíticos. Durante la meiosis el ADN de las gametas puede ser afectado por crossing-over lo que genera nuevas recombinaciones además de las de origen materno y paterno. La frecuencia de éstas es un índice para la posibilidad de un crossing-over y la distancia entre loci investigados. Para estos estudios se adecuan individuos que son heterocigotas en ambas localizaciones examinadas. La amplificación simultánea de ambas regiones obtenidas de espermatozoides individuales y la posterior determinación del alelo para ambos loci permite identificar la variante de los padres como así también la recombinante (LI y col., 1988). En los ciclos iniciales se lleva a cabo una amplificación simultánea de ambos loci con dos pares de iniciadores (reacción PCR múltiple), luego se dividen los componentes para amplificar cada región separadamente. La detección de las variantes del alelo se lleva a cabo mediante la hibridación de las amplificaciones con aligonucleótidos específicos para el alelo marcado radiactivamente (OEA) o no. Los resultados de la tipificación de espermatozoides individuales demuestran que en 20% de los mismos no se produce amplificación. Para obtener resultados confiables estadísticamente se requiere evaluar una cantidad abundante de espermatozoides. A pesar que el trabajo con las células espermáticas individuales es relativamente complicado, este método es de gran valor para la obtención de cartas génicas, porque brinda resultados rápidos independientes del intervalo generacional. Determinación del sexo El sexado confiable de los embriones en estadios preimplantatorios es un problema actual en programas de TE. Existieron diferentes intentos para determinar el sexo: métodos inmunológicos o citogenéticos y otros mediante técnicas de ADN. Cabe destacar que se probó intensamente como alternativa de clasificar los espermatozoides antes de la fertilización. Los métodos que se fundaban en el diferente peso específico de los cromosomas X e Y demostraron no ser adecuados por la alta variabilidad del contenido citoplasmático. Igualmente el intento de seleccionar los espermatozoides X e Y según su motilidad en función del pH produjo resultados insatisfactorios. La detección inmunológica depende del reconocimiento específico del antigen HY propio del sexo masculino (BOOMAN, 1989). Este método dio resultados no confiables y mostró ser inadecuado para la aplicación práctica. La representación citogénica de los cromosomas sexuales es relativamente exigente y requiere para la determinación confiable del sexo un número alto de blastómeros. El problema principal de la determinación del sexo mediante sondas específicas para el ADN del cromosoma Y es el largo procesamiento y la baja sensibilidad de los sistemas de hibridación. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Reacción en cadena de polimerasa 195 También en este campo de diagnóstico del sexo la aplicación de la reacción PCR promovió una nueva estrategia en la búsqueda de una solución. En principio una sola copia del ADN-matriz es suficiente para amplificar una región. Como fue mencionado al tratar la amplificación del ADN de los espermatozoides, en algunos casos, el ADN de una célula no es suficiente para una amplificación exitosa. Por ello, para diagnosticar el sexo es conveniente disponer de 2 a 3 blastómeros para amplificar el ADN. Luego de aislar los blastómeros por medio de microcirugía, las células deben ser lisadas con el propósito de liberar el ADN genómico para su posterior amplificación. Para la amplificación de las secuencias del sexo se dispone de diferentes pares de iniciadores (p.e. BRY4a, REED y col., 1989). A menudo se eligen secuencias repetidas de los cromosomas sexuales para la amplificación. De esta forma se dispone desde un principio de un número mayor de copias, facilitando notablemente la obtención de la cantidad necesaria de amplificaciones para el análisis. En consecuencia se necesitan menos ciclos de amplificación (20 a 25), obteniéndose resultados más rápidos. Al amplificar secuencias específicas del cromosoma Y se obtienen amplificaciones sólo en embriones masculinos (HERR y col., 1990a, b). Para excluir errores durante la reacción es conveniente amplificar una región autosomal (GROBET y col., 1992). Esto hace necesario una reacción PCR múltiple con 2 pares de iniciadores por lo menos. La cuestionable relevancia del control de la reacción fue mencionada anteriormente. Una posibilidad alternativa para la amplificación de las secuencias específicas del sexo es la amplificación de las secuencias presentes tanto en el cromosoma X como en el Y. Estas secuencias, sin embargo, se diferencian por medio de mutaciones propias del tipo de cromosoma. Un ejemplo para dichas secuencias son los genes ZFX y ZFY (Zinc, MARDON y PAGE, 1989). Se trata de genes con una sola copia (Single Copy Gene) que existen tanto en el cromosoma Y como en el X. Ambos se diferencian, sin embargo, en un corto fragmento de la secuencia. Uno tiene un lugar de corte para la endonucleasa, el otro no. Esto conduce a un polimorfismo del largo de los fragmentos después de la restricción de las amplificaciones (REEP) con dicha enzima. Los iniciadores para las amplificaciones específicas de los genes ZFX y ZFY son aptos para un amplio espectro de especies. Ambos iniciadores son 25-meros, el iniciador 5-'P1-5EZ tiene la secuencia: 5'ATAATCACATGGAGAGCCACAACT-3. El iniciador 3'- tiene la secuencia: 5'GCATTTCTTTTGGTTATCTGACAAAGT-3' Los RFLPs de las ampliaciones fueron observados en las especies humana, bovina, ovina y caprina (AASEN y MEDRANO, 1990). La tabla 1 presenta los RFLPs observados en las esas especies. Tabla 1: Largo de los fragmentos y enzimas de restricción para la demostración del RFLP de los genes ZFX (445pb) y ZFY (447 pb) Especie Enzima Largo de fragmento (pb) ZFX ZFY Humana HaeIII 400+45 317+84+46 Bovina PstI 445 344+103 Ovina SacI 272+173 447 Caprina SacI 272+173 447 Las amplificaciones tratadas con la correspondiente enzima de restricción o las amplificaciones específicas del cromosoma Y con sus correspondientes pruebas de control son separadas en gel de agarosa y coloreadas con bromuro de etidio. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Dovc 196 Foto 1: Amplificación de la secuencia específica repetida del cromosoma Y y RFLP de las amplificaciones específicas de los cromosomas X e Y. Las columnas 1 y 8: 100 pb marcador, columna 2: amplificación del ADN femenino con un iniciador específico del cromosoma Y. Columna 4 y 5: amplificación de los ADN masculino y femenino con iniciador P1-5EZ/P2-3EZ. Columna 6 y 7: división enzimática de los amplificadores de los ADN masculinos y femeninos con los iniciadores P1-5EZ/P2-3EZ Caracterización del genotipo Las características cuantitativas son de importancia para la zootecnia práctica. Estas son determinadas en forma poligénica y hasta el momento poco accesibles a los análisis de genética molecular. Pero hay algunos ejemplos que ilustran la importancia de algunos genes individuales para la producción animal. Las proteínas de la leche representan una familia de genes sumamente polimorfa. Las distintas variantes se distinguen en mutaciones puntuales y pequeñas pérdidas en el genoma. Existe especial interés en caracterizar la caseina y la lactoglobulina ß. Ambas enzimas tienen influencia sobre las cualidades de la leche (GRAML y col., 1987). Con la elección de iniciadores adecuados se pueden amplificar regiones polimorfas e identificar mutaciones puntuales mediante el RFLP. La principal ventaja de este método es la independencia de la expresión génica (el sistema es aplicable también en animales machos) y su rapidez (LIN y col., 1992). Control de la descendencia Para el control de la descendencia se aplican comúnmente secuencias altamente polimorfas y repetidas las cuales forman, en combinación con diferentes sondas, un sistema de alto poder de resolución. Con éste se pueden hacer afirmaciones estadísticamente seguras sobre la descendencia. Frecuentemente se utilizan regiones microsatélites (denominadas también VNTR, variable number of tandem repeat). Algunos alelos se distinguen en el largo de las repeticiones tándem (tandem repeat). Después de la amplificación con iniciadores que flanquean estas regiones se puede, luego de separar las amplificaciones en gel secuencial, identificar los polimorfismos. Con la combinación de varios loci aumenta el poder resolutivo de este método (GEORGES y col., 1991). Con fines forenses se emplean regiones con repeticiones de Tri- o Tetranucleótidos junto con los VNTRs. Para la aclaración de la descendencia materna se dispone del análisis de la secuencia de la región hipervariable (D-loop). En las especies mamíferas el ADNmt es de herencia materna y está presente en numerosas copias por célula. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Reacción en cadena de polimerasa 197 Diagnóstico de enfermedades hereditarias Las enfermedades hereditarias dependientes de un solo gen, con mutaciones bien definidas y que causan el desarrollo de los síntomas clínicos, son apropiadas para el diagnóstico por medio de la reacción PCR. El método se basa en la ampliación de la región que puede estar afectada por la mutación. En principio puede tratarse de mutaciones puntuales o pérdidas (deletions) en el genoma. Para el diagnóstico se disponen básicamente de 3 alternativas: hibridación de las amplificaciones con oligonucleótidos específicos para el alelo (OEA), análisis de restricción de las amplificaciones y determinación directa de la secuencia de la región amplificada. Con el surtido de endonucleasas disponibles actualmente en el mercado, es posible encontrar para casi todas las secuencias una enzima apropiada. Para la determinación directa de la secuencia de los productos de la reacción PCR se ofrecen varias alternativas. Una posibilidad es la concepción de una reacción PCR en la cual solo en los primeros ciclos ambas cadenas son sintetizadas. A continuación predomina la síntesis de una cadena. El incremento del producto de la reacción PCR es lineal en lugar de exponencial). Finalmente el producto es una cadena simple de ADN, la cual puede ser utilizada directamente como matriz para la secuencia a determinar. Otra posibilidad es la determinación directa de la secuencia del producto de cadena doble de la reacción PCR. Esto, sin embargo, parece ser difícil sobre todo con amplificaciones cortas. Una última posibilidad la presenta, por supuesto, el clonado de las amplificaciones y el posterior análisis de los clones recombinantes. Un ejemplo para el análisis de restricción de las amplificaciones es la detección de la anemia falciforme del hombre (SAIKI y col., 1985). Para ese fin se amplifica una región con un largo de 725 pb del gen de la -globulina y luego se divide la amplificación mediante la enzima CvnI. Con ello se obtienen dos fragmentos constantes (256 y 88 pb) y un fragmento de 381 pb de largo. Este puede ser dividido en dos subfragmentos (201 y 180 pb) si proviene de un individuo sano. En cambio en individuos con anemia falciforme una mutación puntual causa la pérdida del lugar de reconocimiento para la enzima (KAZAZZIAN, 1989). La identificación directa de la mutación es posible después del análisis electroforético de las ampliaciones tratadas enzimaticamente. La citrulinemia es una enfermedad hereditaria del bovino provocada por una mutación puntual en el gen de la enzima argininasuccinato sintetasa. En los animales que padecen esta enfermedad, el codón 86, que normalmente codifica para arginina, se transforma en un codón stop. La consecuencia es un producto génico corto en el locus que impide el normal desenvolvimiento del ciclo metabólico de la urea provocando un aumento de la concentración de citrulina con alteraciones patológicas. La mutación modifica también el lugar de reconocimiento de la endonucleasa AvaII, presente en animales sanos, de forma tal que en los animales con esa deficiencia genética el lugar con AvaII no se puede separar. Con la elección de una iniciador adecuado es posible amplificar una fragmento de 176 pb de largo, que produce dos fragmentos (98 bp + 78 pb) cuando los animales sanos son tratados con AvaII. En los animales enfermos falta el lugar de reconocimiento para AvaII (FÖRSTER, 1991). Diagnósticos de rutina para la talasemia- se basan en la hibridación específica del ADN amplificado con oligonucleótidos específicos para el alelo en combinación con el análisis de restricción. Aproximadamente la mitad de los más de 60 mutantes de la talasemia son identificables mediante el análisis de restricción. Las mutantes restantes son diagnosticables mediante el análisis de restricción. El resto de las mutantes es diagnosticable por medio de la hibridación Dot-blot con oligonucleótidos específicos para el alelo. La precisión del lavado debe ser establecida de tal manera que la diferencia entre las fuerzas de la señal de hibridación entre homocigotas y heterocigotas sea detectable con claridad. La secuenciación de las regiones amplificadas cobra particular importancia en la identificación de nuevas mutantes (WONG y col., 1987). Defectos ocasionados por pérdidas pequeñas pueden ser diagnosticados mediante la selección de iniciadores apropiados para ambos lados del lugar presumible de la pérdida. Un ejemplo de ello es el Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 198 Dovc diagnóstico de la distrofia muscular Duchenne. En una reacción PCR se emplean 18 iniciadores, que limitan 9 regiones más comúnmente afectadas por pérdidas del gen distrofin. La falta de las amplificaciones de la región determinada indica la mutación. En general este método es limitado por el largo de la amplificación en individuos sin pérdidas, dado que la amplificación de regiones que superan 2 kB es problemática y poco adecuada para el diagnóstico de rutina. Comprobación del transgen Como ocurrió en otras áreas de la genética molecular, la reacción PCR encontró rápidamente su aplicación en el diagnóstico de transgénesis. En la concepción del sistema de comprobación se hace uso, sobre todo, de las particularidades de la secuencia transferida. Se intenta amplificar los fragmentos del transgen no presentes en el ADN genómico endógeno o aquellos diferentes de la secuencia endógena (p.e. mutaciones puntuales que modifican las secuencias de reconocimiento para las endonucleasas, pérdidas, inserciones, etc.). En algunos casos el transgen se diferencia de la secuencia endógena por la falta de secuencias vectores o por las regiones promotoras. En ambos casos la presencia de elementos heterólogos puede ser utilizada para el diseño de iniciadores. Mediante la evaluación cuantitativa de la reacción PCR se puede deducir el número de copias del transgen. Con ese fin se lleva a cabo a menudo una co-amplificación en un locus endógeno para estimar la cantidad de la amplificación del transgen en función de la producción estandarizada de amplificaciones del locus de referencia. De singular importancia es la evaluación de la reacción PCR en la fase logarítmica dado que las diferencias causadas por la distinta cantidad original de ADN matriz son evidentes sobre todo en ese momento. El mejoramiento de la cuantificación significa una marcación estandarizada, covalente de las amplificaciones (iniciadores marcados en forma fluorescente). Diagnóstico de enfermedades infecciosas La reacción de PCR se ofrece como método diagnóstico para detectar infecciones, sobre todo las subclínicas porque su sensibilidad permite la detección de cantidades mínimas de ADN (teóricamente una sola copia de la molécula matriz es suficiente). Es posible comprobar secuencias integradas en el genoma (p.e. infecciones retrovirales) como también la presencia de secuencias episomales y extracelulares propias de las infecciones. La reacción de PCR facilitó un progreso importante en la investigación HIV. Se posibilitó el diagnóstico de secuencias provirales HIV-I de las células mononucleares de la sangre periférica, obtenida de pacientes sero-positivos; a pesar que no fue posible confirmar la infección a través del cultivo del virus (OU y col., 1988). De especial importancia es la aplicación de la PCR en el diagnóstico de infecciones subclínicas provocadas por agentes difícilmente cultivables in vitro. La elección del iniciador específico de especie garantiza la identificación del agente infeccioso. El polimorfismo en las regiones específicas de especie permite la identificación de las distintos tipos (DOVC y col., 1992). De esta forma se dispone, en el estudio etiológico de las infecciones, de un método eficaz que puede aclarar también los interrogantes forenses. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Reacción en cadena de polimerasa 199 Apéndice Protocolo de laboratorio para la amplificación de la región ZFX y ZFY de blastómeros. 1. 2. 3. 4. 5. Los blastómeros obtenidos por medio de microcirugía son suspendidos en 5µl de medio y transferidos a un tubo de ensayo Eppendorf. Se añaden 20 µl de agua bidestilada a fin de alcanzar un volumen final de 25µl. Posteriormente los blastómeros (3-5) son congelados cíclicamente 10 veces en hielo seco y descongelados a 96o C en un termociclador. En el último ciclo el tratamiento térmico es prolongado a 10 minutos. Luego las pruebas son mantenidas en hielo. Para la reacción PCR se prepara la siguiente solución "Master-mix" (expresada en µl): H2O 8,5 10 x buffer 5,0 dNTPs 5,0 Iniciador 3,0 + 3,0 Polimerasa Taq 0,5 25µl de Master-mix son incorporados a la solución con los blastómeros lisados. Todo se cubre con 60µl de parafina. La reacción de PCR se lleva a cabo en el termociclador: 1 min: 94o C 1 min: 60o C 1 min: 72o C 25 ciclos En el primer ciclo se prolonga el primer paso a 5 min y en el último ciclo el último paso a 4 min. 6. 7. Después de 25 ciclos se añade 0,5 ml de polimerasa Taq, posteriormente se sigue con otros 25 ciclos. Después de 50 ciclos se produce la división enzimática de las amplificaciones. Luego la electroforesis en gel. Bibliografía AASEN, E. and MEDRANO, J.F. 1990. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Bio/technology, 8: 1279-1281 BOOMAN, P. 1988. Sexing of bovine preimplantation embryos. 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