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Fenotipo_mutador GENES DE REPARACIÓN DEL DNA. EL FENOTIPO MUTADOR Entre otras cuestiones, en las células cancerosas ocurren dos tipos de alteraciones: • Alteraciones genéticas: Fenotipo Mutador • Alteraciones epigenéticas: Hipermetilacion y de metilacion del ADN (proceso dependiente de la edad) ?wear and tear?. Estudios de Genética Molecular del cáncer de colon revelan que los tumores surgen como resultado de la acumulación de mutaciones en los oncogenes y genes supresores durante etapas sucesivas del desarrollo tumoral. De hecho, el primer modelo propuesto para explicar el origen de un tumor es el modelo de acumulación de mutaciones eventualmente irreversibles. Estas mutaciones oncogénicas, que activan los oncogenes e inactivan los genes supresores tumorales, ocurren por acción de mutágenos exógenos o por fallos en la replicación y reparación del DNA (mutaciones mutadoras), que explican el origen endógeno de las mutaciones oncogénicas. La técnica desarrollada por J. Welsh y M. McClelland consistente en una modificación de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) denominada AP-PCR, constituyó la base para el desarrollo de la técnica del fingerprinting para detectar posibles mutaciones en el DNA. Esta técnica permite comparar patrones de bandas de DNA de tejido normal y DNA de tejido tumoral, que refleja alteraciones somáticas en el genoma del tumor en comparación con el genoma constitutivo. La técnica de AP-PCR utiliza modificaciones de la PCR clásica, donde se usa un solo primer arbitrario (seleccionado al azar) para amplificar el DNA y se realiza a baja temperatura, permitiendo la hibridación en múltiples sitios del DNA genómico y, por tanto, la acumulación de errores de apareamiento de bases (mismatch). Posteriormente, una DNA polimerasa sintetiza la cadena complementaria, que ha incorporado las mutaciones. En un segundo ciclo, el mismo primer vuelve a hibridar a temperaturas bajas con algunas secuencias amplificadas en el primer ciclo, y la DNA polimerasa vuelve a sintetizar la hebra complementaria. El final de la reacción, ya no hay más mismatch porque la enzima sintetiza la secuencia complementaria perfecta a la que había inicialmente (originada con el primer arbitrario). Desde este momento se repiten los ciclos a temperatura elevada obteniéndose un patrón de bandas reproducible. Aplicando esta técnica para comparar DNA de tejido normal y tumoral se encontraron diferencias cualitativas y cuantitativas entre ambos. Los cambios cuantitativos reflejan en el genoma del tumor una pérdida o una ganancia de secuencias genómicas que determina los fenotipos aneuploides. Los cambios cualitativos revelaron que algunas de las bandas de los DNA-fingerprinting de DNA tumoral se movían más deprisa (eran más pequeñas) en relación con el DNA homólogo de tejido normal. Esta movilidad indicó que los tumores acumulan un enorme número de mutaciones somáticas, calculada en aproximadamente 100.000 mutaciones, que corresponden a deleciones en secuencias repetidas del genoma (inestabilidad de microsatélites). Estos tumores responden al fenotipo mutador postulado años antes, que propone que las células tumorales tienen una tasa de mutaciones mucho más elevada que las células normales. El mecanismo que genera estas mutaciones mutadoras en la replicación, deleciones o inserciones de un nucleótido en secuencias repetidas, es el desalineamiento de las dos cadenas de DNA durante sucesivas rondas de replicación, lo que origina una acumulación de mutaciones que se reflejan en la existencia de deleciones o inserciones en el genoma. La frecuencia de deleciones es mayor que la frecuencia de inserciones. Posteriormente se descubrió que estas mutaciones mutadoras se originaban por genes mutadores (genes de reparación de mismatch del DNA) y que son responsables del cáncer de colon hereditario no polipósico (HNPCC) y una minoría de tumores del tracto gastrointestinal. Estas células tumorales tienen genes mutadores 1
Fenotipo_mutador defectivos que provocan la acumulación de mutaciones. Todos estos descubrimientos denotan la existencia de una ruta de ?control remoto? (ruta mutadora). El fenotipo mutador no ocasiona el cáncer de manera directa sino de manera indirecta ya que es responsable de la presencia de mutaciones en los genes supresores de tumores. Un gen mutador no es un oncogén ni un gen supresor de tumores. Además de las diferencias observadas en los fenotipos de los tumores con fenotipo mutador, se observaron diferencias en su genotipo; en los genes de tumores con fenotipo mutador (APC, K-RAS y p53) el número de mutaciones es menor que en tumores sin fenotipo mutador. Esto se explicó años más tarde porque en los tumores de fenotipo mutador hay mutaciones en otros genes diferentes que no están mutados en los tumores que no son de la ruta mutadora. Los tumores del fenotipo mutador tienen un espectro de genes del cáncer mutados muy diferente del espectro de genes del cáncer mutados en los tumores de la ruta supresora. Hasta la actualidad, se han descrito más de 100 genes mutados en tumores con fenotipo mutador, más del 80% de estos tumores tienen mutaciones en las regiones microsatélite repetidas codificantes en los dos alelos de genes diana, que son funcionales en el proceso tumoral y otras, también bialélicas, en secuencias neutras; pero además, existen mutaciones en un solo alelo de estos genes que son funcionales y tienen implicación en muchos tipos de tumores. En general, los tumores de colon que no tienen fenotipo mutador presentan una mutación bialélica siempre en el mismo gen (APC), los demás genes implicados en las rutas de señalización no están mutados; mientras que los tumores con fenotipo mutador pueden tener mutaciones en uno o los dos alelos en distintos genes de las rutas de señalización. En estudios realizados para explicar la distribución de mutaciones en los microsatélites en tumores, se comprobó la existencia de una distribución bimodal, es decir, existen tumores que no presentan ninguna mutación y una minoría de tumores que tienen gran cantidad de mutaciones; por este tipo de distribución se puede demostrar la presencia de un fenotipo mutador. Mediante técnicas de DNA-fingerprinting se puede determinar el grado de daño genético acumulado en los distintos tipos de tumores; así, los tumores con mayor daño genético tienen menor supervivencia y peor prognosis. El proceso de desarrollo tumoral desencadenado por una alteración epigenética se asocia al silenciamiento del gen mutador por acumulación de metilaciones en las islas CpG que están en su región promotora. Las alteraciones epigenéticas son importantes para la regulación génica. La metilación de las histonas produce la represión de la expresión del gen, y cuando se traslada al DNA se produce un silenciamiento génico estable de estos genes. En paralelo con el fenotipo mutador se postuló la existencia de un fenotipo metilador, que afectaba a tumores con muchas alteraciones en la metilación de ciertos genes, entre ellos, los genes mutadores. Esto explicaría la existencia de una ruta ?control ultra-remoto?, donde el gen metilador no ocasiona el cáncer directamente sino que lo hace a través de dos etapas intermedias: la inactivación del gen mutador, que ocasiona el fenotipo mutador y mutaciones en los genes del cáncer. La distribución de mutaciones por alteraciones en los patrones de metilación de ciertos genes no es bimodal, sino gradual, es decir, hay distinto grado de acumulación de estas alteraciones epigenéticas en los distintos tumores. Mediante el uso de técnicas de marcaje radiactivo del DNA se ha podido determinar qué secuencias están hipermetiladas en el tejido tumoral respecto al tejido normal, y viceversa. Así, al igual que se realizó con el fenotipo mutador, mediante técnicas de fingerprinting, se han podido establecer los patrones de metilación del genoma, que han revelado que las alteraciones en la metilación no son debidas a un fenotipo metilador, no se puede determinar la frecuencia de metilación en células normales y distintas células tumorales. Las alteraciones en la metilación de estos tumores están asociadas a la edad de los pacientes. Comparando la presencia de mutaciones en tumores con fenotipo mutador, se puede ver que los genes que tienen metilaciones en el gen mutador están presentes en pacientes de mayor edad que aquellos que no tienen metilación en el gen 2
Fenotipo_mutador mutador. Estas diferencias en el grado de metilación (alteraciones epigenéticas) de los genes mutadores en relación con la edad del paciente no se encuentran presentes en las alteraciones genéticas, no son dependientes del envejecimiento. En el caso de los tumores de la ruta mutadora, las alteraciones epigenéticas ocurren antes que las alteraciones genéticas y son responsables de la ocurrencia de las mismas. En los tumores que no tienen fenotipo mutador, no hay evidencia de que estas alteraciones epigenéticas precedan a las alteraciones genéticas en el desarrollo del tumor. Además, ciertos resultados obtenidos de otros estudios sugieren que los cambios de hipometilación pueden tener una vinculación causal sobre las alteraciones genéticas y cromosómicas.
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