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Curso de Enzimología, Facultad de Ciencias
2010
Ensayos acoplados – Sistema glucosa oxidasa/peroxidasa Docentes: Beatriz Alvarez y Martín Fló Diseño y puesta a punto: Natalia Romero y Eugenio Prodanov Objetivo a. Determinación de la concentración de peroxidasa a utilizar en el ensayo acoplado a la reacción catalizada por la glucosa oxidasa. b. Determinación de los parámetros cinéticos de la glucosa oxidasa utlizando un ensayo enzimático acoplado con peroxidasa y ácido 2,2’-azinobis(3etilbenziltiazolina)sulfónico (ABTS). Fundamento La glucosa oxidasa (β-D-glucosa:oxígeno 1-oxidorreductasa, EC 1.1.3.4) es una flavoenzima que se aísla de Aspergillus niger. La enzima es dimérica y cada monómero tiene una masa molecular de 80,000 daltons. La oxidación de la glucosa por la enzima da como productos ácido glucónico y peróxido de hidrógeno, el cual a su vez es sustrato de la peroxidasa de rábano (HRP, del inglés horseradish peroxidase). La reacción del peróxido de hidrógeno con la HRP da lugar a la formación del compuesto I (complejo enzima-sustrato), el cual oxida al ABTS por un electrón a radical catión ABTS (ABTS.+), que absorbe a 415 nm, quedando como compuesto II, el cual también oxida al ABTS. La velocidad de formación de ABTS.+ en condiciones de exceso de HRP es proporcional a la velocidad de consumo de glucosa por reacción con la glucosa oxidasa. glucosa + O2 → ácido glucónico + H2O2 (glucosa oxidasa) .+ H2O2 + 2 ABTS → 2 ABTS + 2 H2O (HRP) Materiales Amortiguador fosfato, 0.05 M, pH 5.9. Glucosa 1 M (se prepara el día antes para permitir la mutarrotación). Glucosa oxidasa 0.25 U/mL (se utiliza enzima de Sigma que tiene 332 U/mg proteína; se mantiene en frío). HRP 10 µg/mL (0.5 U/mL; se utiliza enzima de Sigma; se mantiene en frío). ABTS 1 mM (se utiliza recién preparado y se protege de la luz). Protocolo experimental a. Determine la velocidad de la reacción catalizada por la glucosa oxidasa en presencia de concentraciones crecientes de peroxidasa de rábano de acuerdo al siguiente esquema: Glucosa 1M ......................................0.5 mL ABTS 1 mM.......................................0.2 mL HRP 10 µg/mL..................................20 µL a 0.5 mL Glucosa oxidasa 0.25 U/mL..............0.1 mL Amortiguador ...................................c.s.p. 3.0 mL Grafique la velocidad de formación del ABTS.+ (µM/min) en función de la concentración de HRP teniendo en cuenta que el ε415 del ABTS.+ = 3.6 x 104 M-1 cm-1 (Re et al., 1999, Free Radic. Biol. Med. 26:1231-7). b. A partir de la concentración de HRP óptima determinada en la parte anterior, elabore un protocolo a fin de determinar los parámetros cinéticos de la glucosa oxidasa, asumiendo que el KM de esta enzima es aproximadamente 40 mM. Determine KM para la glucosa, Vmax y Vmax/KM de la glucosa oxidasa.