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Naturaleza y Desarrollo
Vol.9, Núm. 2, Julio-Diciembre, 2011
Respuesta Fisiológica del Dinoflagelado Prorocentrum micans (Ehrenberg, Vide Balech 1988) a Diferentes Concentraciones de Fosfatos Physiological Response of the Dinoflagellate Prorocentrum micans (Ehrenberg, Vide Balech 1988) to Different Concentrations of Phosphates M.O. Albañez-Lucero, A. Martínez-López, G. Verdugo-Díaz. Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas, I.P.N. Av. Instituto Politécnico Nacional S/N Col. Playa Palo de Santa Rita, C.P. 23096, La Paz, B.C.S., México. *Correspondencia:
[email protected] Resumen. El presente estudio muestra los resultados del crecimiento del dinoflagelado Prorocentrum micans en un medio f/2 modificado con dos concentraciones de fosfato. Las células se cultivaron a una concentración normal (2.31 μM), las cuales alcanzaron una densidad de 19,285 células mL–1 al sexto día; las células cultivadas a una baja concentración (1.17 μM) alcanzaron una densidad de 7,122 células mL–1. El volumen celular en el medio con baja concentración de fosfatos fue ~4,810 µm3 y el volumen celular del medio con concentración normal fue ~5,564 µm3. El contenido de Carbono en el medio de concentración normal alcanzó ~529 pgC células–1, y en el medio de baja concentración fue ~612 pgC cell–1. La tasa de absorción de fósforo fue mayor en el medio de cultivo normal. La respuesta fisiológica del P. micans a las concentraciones de fósforo indican que el crecimiento más rápido y mayor fue bajo condiciones similares a las del medio natural. Palabras clave: volumen celular, tasa de crecimiento, tiempo de generación, medio de cultivo, contenido de carbono. Abstract. The present study shows the results of Prorocentrum micans grown in a modified f/2 medium at two concentrations of phosphate. Cells cultured at a normal concentration (2.31 μM) reached a density of 19,285 cells mL–1 by day 6; cells cultured at a low concentration (1.17 μM) reached a density of 7,122 cells mL–1. Cell volume in the low-concentration phosphate medium was ~4,810 µm3, and cell volume in the normal phosphate medium was ~5,564 µm3. Carbon content in the normal concentration medium reached ~529 pgC cell–1; in the low concentration medium, it reached ~612 pgC cell–1. The phosphorous uptake rate was found to be higher in the normal culture medium. The physiological response of P. micans to phosphorus concentrations indicates that growth is greater and faster under conditions similar to those of the natural environment. Key words: cell volume, growth rate, generation time, culture medium, carbon content.
15 Cita sugerida:Albañez-Lucero, M. O., A. Martínez-López & G. Verdugo-Díaz. Respuesta fisiológica del dinoflagelado Prorocentrum micans (Ehrenberg, Vide Balech, 1988) a diferentes concentraciones de fosfatos. Naturaleza y Desarrollo 9(2):15-25.
Albañez-Lucero et al.
Introducción La afinidad de P. micas por condiciones enriquecidas hace necesario comprender el papel que juega el nitrógeno y el fósforo en la formación de sus proliferaciones. Para la fracción autótrofa de los dinoflagelados, incluyendo a P. micans, el fósforo es un nutriente esencial, sin embargo, poco se sabe del papel que juega en el crecimiento y distribución de este grupo, y del fitoplancton marino en general (Benítez-Nelson, 2000). Esto se debe a que los estudios previos se han centrado sólo en el nitrógeno como el macronutriente que limita la producción primaria en el océano. Zhengbin et al., (2006), propusieron que el óxido nítrico puede favorecer el incremento en la biomasa de P. micans, aunque concentraciones altas pueden inhibir su crecimiento. Recientemente se ha revalorado el papel que juega el fósforo en la producción y distribución del plancton en el océano, generándose evidencia de que el fósforo, más que el nitrógeno, puede limitar la producción de la comunidad fitoplanctónica (BenitezNelson, 2000).
Las especies de Prorocentrum están ampliamente distribuidas en el mundo tanto en la zona templada como la tropical (Faust et al., 1999). En el litoral mexicano se han identificado alrededor de 18 especies (Hernández-Becerril et al., 2000). Entre estas se encuentra P. micans, la cual se distingue como una especie formadora de proliferaciones en áreas oceánicas y lagunas costeras (Smayda, 2002). Sus proliferaciones son iniciadas, aparentemente, con la activación de quistes (Anderson y Morel, 1979; Cannon, 1990) y han sido reportadas principalmente en inviernoprimavera, asociadas con condiciones de enriquecimiento de nutrientes y altas irradiancias (Holmes et al., 1967; PeñaManjarrez et al., 2005; Smayda, 2002). En este tipo de sistemas la ocurrencia de sus proliferaciones es de interés porque, a pesar de no existir registros de que produzcan toxinas, se tiene información de la formación de proliferaciones de carácter nocivo en áreas de surgencias, pues han causado mortandad de peces por el decremento de oxígeno ocasionado por su crecimiento masivo (Kundela et al., 2005).
Las proliferaciones de P. micans no han sido convenientemente explicadas debido a la falta de conocimiento de su fisiología y ecología. Algunos estudios tanto a nivel laboratorio en cultivos monoespecíficos (Kayser y Sperling, 1980; Rabsch y Elbrachter, 1980), como en el ambiente natural (Fisher y Jones, 1981; Subba Rao, 1981) han abordando diversas líneas de investigación como la formación de proliferaciones y/o efectos de metales pesados en el ambiente. Se ha mostrado que su crecimiento varia en
El potencial que tiene esta especie de formar proliferaciones ha sido reconocido y documentado desde hace varias décadas para las costas de California (Allen 1938, 1941) y más recientemente para las costas de la Península de Baja California (Blasco, 1977; Barocio-León et al., 2008; Lechuga-Devéze et al., 2000; OrellanaCepeda et al., 1993, 1999; PeñaManjarrez et al., 2005).
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función de la temperatura y la intensidad de luz (Barker, 1935). Sin embargo, muchos aspectos de su nutrición y fisiología siguen sin conocerse. Así, en este trabajo la cepa de P. micans fue cultivada en un medio normal de fósforo y en otro bajo en fuente de fósforo con el fin de confirmar el efecto de este nutriente en las tasas de crecimiento de la misma.
que en el tratamiento con bajo fósforo (1.17 µM), se utilizo el mismo medio f/2, solamente que fue preparado sin los fosfatos que dicha receta incluye, de esta manera, los fosfatos presentes en este medio fueron únicamente los contenidos en el agua proveniente de la zona de recolecta de esta especie. Los cultivos se mantuvieron bajo periodos de luzoscuridad de 12:12 horas a una temperatura de 21 °C ± 1 °C. Se tomaron muestras durante los días 2, 4 y 6 extrayendo alícuotas de 2 ml y preservándolas en solución de lugol al 1%. Las células fueron contadas bajo un microscopio invertido con un campo claro en una cámara Sedgwick-Rafter de 1 mL de capacidad. La tasa de crecimiento fue calculada de acuerdo a Guillard (1973), el tiempo de generacional (Tg) expresado en días fue determinado a partir de la ecuación Tg = 0.6931 / µm3.
Material y Métodos En este estudio una cepa de P. micans fue cultivada en un medio normal de fósforo y en otro medio de bajo contenido de él, con la finalidad de evaluar su posible efecto limitante en la tasa de crecimiento de esta especie. La cepa de P. micans (PMICBAPAZ) utilizada en la presente investigación fue recolectada en la Bahía de La Paz y aislada mediante micropipeta el 3 de agosto de 2005. Para determinar el efecto del fósforo en el crecimiento de P. micans, se inocularon células hasta una concentración inicial de 2.609 x 103 cel mL-1 en 130 mL de medio de cultivo f/2, durante 6 días, que según nuestra experiencia, es el tiempo en el cual esta cepa alcanza su fase de crecimiento exponencial. El medio de cultivo utilizado fue f/2 (Guillard, 1973) debido a que es un medio que cumple con los requerimientos nutritivos de la mayoría de las especies fitoplanctónicas, entre ellas P. micans, que se caracteriza por tener un crecimiento más rápido que otras especies de dinoflagelados, además soporta cambios bruscos de temperatura y no necesita de aditivos (VargasMontero y Freer, 2002). Se evaluaron dos tratamientos. En el tratamiento con fósforo normal (2.31 µM), se utilizó la receta original del medio f/2, mientras
Al sexto día, las muestras de fitoplancton fueron recolectadas para determinar la concentración de fósforo en el medio de cultivo (Parsons et al., 1984). La determinación en el tratamiento con concentración normal de fosfatos se realizó a los 0 y 60 minutos; mientras que en el cultivo con baja concentración de fosfatos se llevaron a cabo a los 0, 5, 30 y 60 minutos, ya que al haber una menor concentración inicial de fosfatos, está podía ser indetectable con el transcurso del tiempo. Al determinar la abundancia celular mediante los conteos, se seleccionaron al azar 15 células, mismas que fueron medidas para posteriormente determinar su biovolumen según lo propuesto por Sun y Liu (2003), y transformar el equivalente de Carbono, según Edler (1979). 17
Albañez-Lucero et al. Los datos de biovolúmen obtenidos fueron sometidos a una prueba de Bartlett (Sokal, 1969), misma que evidenció que su distribución difería de la normal, debido a esto se decidió contrastar los biovolúmenes de los tratamientos mencionados mediante la prueba no paramétrica de MannWhitney.
en el cual la densidad registrada fue de 19,285 cel mL-1. En relación con la curva de crecimiento obtenida en un medio de cultivo bajo en fosfato, se observó de igual forma un crecimiento exponencial (Figura 1), sin embargo las densidades celulares fueron menores que en el caso anterior, registrando un máximo de 7,122 cel mL-1 al sexto día (Figura 1). Mediante la prueba de Mann-Witney se detectó que las diferencias entre las abundancias observadas en ambos medios fueron significativas (p = 0.001¸ g. l. = 14). El valor promedio de la abundancia obtenido de la población cultivada en el medio f/2 original presentó un valor de 4,808.53 cel mL-1 (± 422.77) mientras que en el medio bajo en fosfatos se registró una abundancia promedio de 5,564.25 cel mL-1 (±403.47).
Resultados Curva de crecimiento Los resultados obtenidos se derivaron de la siembra de P. micans a una densidad inicial de 2,609 cel mL-1 para ambos tratamientos. En el medio de cultivo con concentración normal de fosfatos se observó un crecimiento exponencial sostenido hasta el sexto día (Figura 1),
Figura 1. Respuesta fisiológica del dinoflagelado Prorocentrum micans (Ehrenberg, Vide Balech 1988) a diferentes concentraciones de fosfatos.
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En el medio de fosfato normal, las en fosfatos, para el primer caso fue de células tuvieron una tasa de crecimiento 3.79 cel mL-1 d-1, mientras que para el mayor que las cultivadas en medio bajo segundo de 2.79 cel mL-1 d-1 (Cuadro 1).
Cuadro 1. Parámetros fisiológicos del P. micans en dos medios de cultivo. Tratamiento
Tasa de crecimiento (µ) (días-1)
Tiempo de generación (días)
Tasa de asimilación (pmol·cel-1·h-1)
Medio bajo en fosfatos Medio normal
0.22 0.45
3.10 1.53
0.17 0.040
Los resultados obtenidos de los conteos celulares (abundancia) y la concentración de fosfatos tanto para el tratamiento bajo en fosfato como para el tratamiento con concentración normal de fosfatos se presentan en el cuadro 2.
Biovolúmen y contenido de carbono Las células mantenidas en un medio bajo en fosfatos registraron tallas y contenido de carbono superiores a las mantenidas con medio de cultivo normal. Con base en el contraste de hi-
Cuadro 2. Concentraciones de fosfatos registradas en los tiempos considerados para dos medios de cultivo. ND = No Determinado. Tiempo (minutos)
Medio normal PO4 (µM)
Medio bajo en fosfato PO4 (µM)
0 5 30 60
2.31 ND ND 1.18
1.17 0.91 0.56 0.53
pótesis de Mann-Witney se determinó que existió diferencia significativa (p = 0.001). El promedio para el tratamiento con fosfato normal fue de 4809 ± 846 µm3 en biovolumen y de 529.05 ± 93 pg carbono celular, mientras que el promedio del tratamiento bajo en fosfatos fue de 5564 ± 806 µm3 en biovolumen y de 612 ± 88 pg carbono celular (Figura 2).
posible factor limitante en el crecimiento de esta especie. En los cálculos de captación de fosfatos para el experimento en el que no se agregó este nutriente, se observó un incremento significativo con el tiempo, pues paso de un valor inicial de 3.50 x10-6 µmol cel-1 h-1 a un 3.85 x 10-6 µmol cel-1 h-1, mientras que en el caso del tratamiento con fosfatos el valor único determinado fue de 6.76 x10-7 µmol cel-1 h-1.
El medio de cultivo al que no se le agregaron fosfatos, presentó una concentración inicial de 1.17 µM de este nutriente, estos pudieron provenir de la concentración natural en la zona de recolecta y es la cantidad a evaluar como
Discusión A diferencia de las curvas de crecimiento reportadas por Rodríguez et al. (2005) en las cuales al cultivar P. micans bajo
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Albañez-Lucero et al. 6200
Biovolumen (µm3)
6000 5800
bajo en fosfato
5600 5400 5200 5000
4800 4600
con fosfato normal
4400
a
4200
680
Carbono celular (pg)
660 640
bajo en fosfato
620 600
580 560 540 520
con fosfato normal
500
b
480 460
Figura 2. Biovolumen estimado (± desviación estándar) (a) y contenido de carbono celular calculado; (b) para células mantenidas en medio bajo en fosfatos y en el medio normal f/2.
diferentes concentraciones de nutrientes observaron una fase de poco o nulo crecimiento inicial (aclimatación), en esta investigación no se registró tal situación, lo que sugiere que las células estaban ya adaptadas a las condiciones de cultivo y crecieron de forma exponencial desde un inicio. De igual forma en este trabajo no se observó una fase estacionaria o de crecimiento máximo sostenido al mantener el cultivo por seis días. Es posible que esto se deba al corto tiempo del experimento, ya que
la fase de estabilidad para esta especie ha sido reportada por Rodríguez et al. (2005) a partir de los 12 o 13 días de cultivo. A pesar de que se observó un mayor incremento de la abundancia celular (máximo= 19.28*103 cels mL-1) en el medio normal f/2, la curva del tratamiento bajo en fosfatos también incrementó sus abundancias (7.12 *103 cel mL-1). De acurdo a Elbrachter (1976) P. micans puede alcanzar la fase 20
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estacionaria con abundancias menores a 1000 cel mL-1. Un nutriente es limitante sí la adición del mismo al sistema incrementa la tasa de crecimiento o de producción primaria neta del fitoplancton (Colijn y Cadée, 2003). Nuestros resultados sugieren que se encontró limitación por fósforo en el tratamiento que no se enriqueció con este nutriente.
Esta misma situación pudo ser la responsable de que el tiempo de generación fuera superior en el tratamiento sin fosfatos que en el medio con fosfatos (0.24 y 0.18 días, respectivamente). Es importante considerar que estas especies tienen una gran capacidad de aclimatación al medio para mantenerse creciendo bajo diversas condiciones nutriticionales, aunque no alcancen su crecimiento óptimo.
Prorocentrum micans no fue sujeto a la ausencia de fósforo, ya que las concentraciones de fosfatos registradas en el cultivo al cual no se le agregó este nutriente (1.17µM), son las propias del agua de mar de la zona de estudio, dado que el medio de cultivo fue preparado con agua de mar filtrada y no con agua de mar artificial, al respecto, VillegasAguilera (2009) reporta valores de fosfatos desde 0.007 a 3 µM en esta área de estudio. Al utilizar agua de mar filtrada pudimos mantener la concentración de fosfatos que se encuentran disponibles en el medio natural y de esta manera fue posible evaluar sí tienen un efecto limitante en la población de P. micans. De haber utilizado el agua de mar artificial se hubiera eliminado totalmente el aporte de fosfatos, provocando una posible limitación al crecimiento, sin embargo no se realizó ya que la idea fundamental estriba en evaluar si las concentraciones naturales de fosfatos pudieran ser el factor limitante. De esta forma, se observó que las concentraciones menores de fosfatos pudieron ser utilizadas para el crecimiento de P. micans, dado que el fósforo se encuentra disponible en el medio ambiente marino como fosfato (PO3-4) en concentraciones relativamente pequeñas, además de formas orgánicas disueltas (Benítez-Nelson, 2000).
Biovolúmen y contenido de carbono El observar un crecimiento diferencial entre los tratamientos tiene gran importancia en el estudio de las condiciones necesarias para la supervivencia y capacidad de crecimiento de una población; por un lado las tallas menores observadas en los organismos mantenidos en un medio con fosfatos pueden significar una menor capacidad y velocidad de natación para los organismos dado que la velocidad de desplazamiento es proporcional a la talla del organismo (González-Gil et al., 1994), por lo cual las células de mayor talla pueden tener mayor capacidad de movimiento para acceder a zonas óptimas para su crecimiento y desarrollo. De igual manera el haber registrado mayores tallas y contenidos de carbono en el cultivo con menor concentración de nutrientes reafirma la evidencia de las estrategias de esta especie para contrarrestar la baja disponibilidad de fósforo, reduciendo su crecimiento, utilizando la energía para incrementar su volumen celular y contenido de carbono como una estrategia de mantenimiento, situación que ha sido propuesta como una de las múltiples estrategias del fitoplancton para sobrevivir en medios oligotróficos (Valiela, 1995). 21
Albañez-Lucero et al. Al respecto, Reynolds (1988) sugiere que las células de menor tamaño y con una mayor relación área-volumen serían las más eficientes en la captación de fosfatos, situación contraria a la aquí reportada, sin embargo, al existir variabilidad de la magnitud reportada y tratándose de una misma especie y por consiguiente con adaptaciones y estrategias iguales, este supuesto carecería de fundamento. Quizás esto sea una respuesta de aclimatación y que al haber menores concentraciones de nutrientes las células incrementen su eficiencia en la capacidad de captación para ser competitivas en un medio como este (Chang et al., 2003).
celular fue menor para el caso del tratamiento bajo en fosfatos. Sin embargo, en ninguno de los dos casos se observó la fase estacionaria en la curva de crecimiento. En cuanto a las tallas y contenido de carbono, las células mantenidas en un medio bajo en fosfatos registraron valores superiores a las mantenidas con medio de cultivo normal.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Instituto Politécnico Nacional por el soporte a través de las becas EDI, COFAA y a los proyectos CGPI 20040066, 20050143 y 20060332. Asimismo a la Dra. Christine Band por haber proporcionado la cepa P. En función de estos estudios no es micans estudiada. posible determinar cuál es el nutriente que limita el crecimiento y en qué Literatura citada momento ocurre esta limitación. Es necesario saber cuál es la concentración Allen, W.E. 1938. “Red Water” along del nutriente, la forma en que se the West Coast of the United States in consume y la tasa de reciclaje (Hecky y 1938. Science 88, 55-56. Kilham, 1988). Bajo las condiciones de laboratorio en que se realizó la presente Allen, W.E. 1941. Twenty Years' investigación se encontraron evidencia Statistical Studies of Marine Plankton de que el fósforo puede limitar el Dinoflagellates of Southern California. crecimiento de P. micans, lo cual es Am. Midl. Nat, 26(3), 602-635. coherente con los informes de que el fósforo limita la producción del Anderson J.M. & F.M.M. Morel. 1979. fitoplancton en regímenes que van desde The seeding of two red tide blooms by áreas marinas someras (Fourqurean et the germination of benthic Gonyaulax al., 1992) a regiones oligotróficas del tamarensis hypnocysts. Est. Coast. Mar. Pacífico y Atlántico (Karl y Yanagi, Sc. 8, 224-234. 1997). Barocio-León, O.A., R. Millán-Núñez, E. Santamaría-del-Ángel, A. GonzálezConclusión Silvera, C.C., Trees & E. OrellanaCepeda. 2008. Bio-optical characteristics Aunque en ambos tratamientos, se of a phytoplankton bloom event off Baja observó un crecimiento exponencial de California Peninsula (30–31 ˚N). Cont. Prorocentrum micans, la densidad Shelf Res. 28, 672–681.
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