Blaustein Kappelmacher, Matías. 2007

Transcript

Regulación post-transcripcional de la expresión génica por señales extracelulares Blaustein Kappelmacher, Matías 2007 Tesis Doctoral Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires www.digital.bl.fcen.uba.ar Contacto: [email protected] Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular REGULACIÓN POST-TRANSCRIPCIONAL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POR SEÑALES EXTRACELULARES Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas Matías Blaustein Kappelmacher Directora de Tesis: Dra. Anabella Srebrow Consejero de Estudios: Dr. Alberto R. Kornblihtt Lugar de trabajo: Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias (IFIBYNE) - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas Y Técnicas (CONICET); Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular (LFBM) - Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires. Buenos Aires , 2007 "REGULACIÓN POST-TRANSCRIPCIONAL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POR SEÑALES EXTRACELULARES" Página de Jurado y calificaciones 2 Regulación post-transcripcional de la expresión génica por señales extracelulares El splicing alternativo del precursor del RNA mensajero es una fuente extraordinaria de diversidad proteica y la regulación de este proceso es crucial para diversas funciones celulares tanto en situaciones fisiológicas como patológicas. Sin embargo, poco se sabe acerca de las señales y vías que regulan el splicing alternativo. Un modelo relevante de este proceso es provisto por la fibronectina, que contiene tres regiones de splicing alternativo conocidas como EDI, EDII y IIICS. Encontramos que diferentes factores de crecimiento estimulan la inclusión de EDI y de IIICS pero no la de EDII en el RNA maduro de la fibronectina en diferentes líneas celulares, favoreciendo isoformas de fibronectina asociadas con la proliferación, migración y remodelado de tejidos. Caracterizamos a la vía de supervivencia Ras-fosfatidilinositol 3-quinasa-AKT/Proteína quinasa B como la principal responsable de esta regulación. Mostramos que los factores de crecimiento gatillan la fosforilación de proteínas ricas en serina/arginina tales como SF2/ASF y 9G8, las cuales son importantes reguladores del splicing y probamos que AKT/Proteína quinasa B funciona como una proteína quinasa de proteínas ricas en serina/arginina. Asimismo, mostramos que los factores de crecimiento no sólo modifican el patrón de splicing alternativo de la fibronectina sino que también alteran la traducción de RNAs reporteros conteniendo una secuencia de EDI responsable de la unión de proteínas ricas en serina/arginina, sugiriendo dos niveles co-regulados de amplificación específica de isoforma. Tanto la regulación del splicing como la de la traducción en respuesta a factores de crecimiento son inhibidas por RNAs pequeños de interferencia contra SF2/ASF y 9G8. Finalmente, mostramos que SF2/ASF es capaz de regular la diversidad proteómica alterando el balance entre diferentes mecanismos de iniciación de la traducción, expandiendo aún más su ya descripto potencial para aumentar el repertorio proteico. Palabras clave: Splicing alternativo, traducción, fibronectina, proteínas ricas en serina/arginina, AKT/Proteína quinasa B Resumen 3 Post-transcripcional regulation of gene expression by extracellular signals Alternative splicing of messenger RNA precursors is an extraordinary source of protein diversity and the regulation of this process is crucial for diverse cellular functions in both, physiological and pathological situations. However, little is known about signals and pathways regulating alternative splicing. A relevant model of this process is provided by fibronectin, which contains three alternatively spliced regions known as EDI, EDII and IIICS. We found that different growth factors stimulate EDI and IIICS but not EDII inclusion into fibronectin mature RNA in different cell lines, favoring fibronectin isoforms associated with proliferation, migration and tissue remodeling. We characterized the Ras-phosphatidylinositol 3-kinase-AKT/Protein kinase B survival pathway as the main contributor to this regulation. We show that growth factors trigger phosphorylation of serine/arginine-rich proteins such as SF2/ASF and 9G8, which are important regulators of splicing and prove that AKT/Protein kinase B functions as a serine/arginine-rich protein kinase. We also show that growth factors not only modify fibronectin alternative splicing pattern but also alter translation of reporter RNAs containing an EDI sequence responsible for serine/arginine-rich binding, suggesting two co-regulated levels of isoform-specific amplification. Both, regulation of splicing and translation by growth factors are inhibited by small interfering RNAs against SF2/ASF and 9G8. Finally, we show that SF2/ASF regulates proteomic diversity by altering the balance between different translation initiation mechanisms, expanding its already described potential to increase protein repertoire even further. Key words: Alternative AKT/Protein kinase B Abstract splicing, translation, fibronectin, serine/arginine-rich proteins, 4 La mayoría de los experimentos y métodos descriptos en esta tesis figuran en las siguientes publicaciones: SF2/ASF regulates proteomic diversity by affecting the balance between translation initiation mechanisms. Blaustein, M., Quadrana, L., Pelisch, F. and Srebrow, A. Manuscrito enviado para su publicación. Signals, pathways and splicing regulation. Blaustein, M., Pelisch, F. and Srebrow, A. International Journal of Biochemistry & Cell Biology (2007) 39: 2031-2048. Concerted regulation of nuclear and cytoplasmic activities of SR proteins by AKT. Blaustein, M.; Pelisch, F.; Tanos, T.; Muñoz, M.J.; Wengier, D.; Quadrana, L.; Sanford, J.R.; Muschietti, J.P.; Kornblihtt, A.R.; Cáceres, J.F.; Coso, O.A. and Srebrow, A. Nature Structural and Molecular Biology (2005), 12:1037-1044. Seleccionado artículo del mes en Nature Structural and Molecular Biology Comentado en “News and Views”, Nature Structural and Molecular Biology (2005) 12 (12): 1022-1023. Seleccionado en Faculty of 1000 Biology, 19 Dic 2005, http://www.facultyof1000.com/article/16299516/evaluation Cross-talk between signaling pathways regulates alternative splicing: A novel role for JNK. Pelisch, F.; Blaustein, M.; Kornblihtt, A.R. and Srebrow, A. Journal of Biological Chemistry (2005), 280: 25461-69. Comentado en Science STKE, Vol. 2005, Issue 292, pp. 251, 12 de Julio 2005. Mammary epithelial-mesenchymal interaction regulates fibronectin alternative splicing via phosphatidylinositol 3kinase. Blaustein, M.; Pelisch, F.; Coso, O.A.; Bissell, M.J.; Kornblihtt A.R. and Srebrow, A. Journal of Biological Chemistry (2004), 279:21029-37. A slow RNA polymerase II affects alternative splicing in vivo. de la Mata, M.; Alonso, C.R.; Kadener, S.; Fededa, J.P.; Blaustein, M.; Pelisch, F.; Cramer, P.; Bentley, D.; and Kornblihtt, A.R. Molecular Cell (2003), 12: 525-532. Seleccionado en Faculty of 1000 Biology, 23 Sep 2003, http://www.f1000biology.com/article/14536091/evaluation Control of alternative pre-mRNA splicing by RNA Pol II elongation: faster is not always better. Nogués, G.; Kadener, S.; Cramer, P.; de la Mata, M.; Fededa, J.P.; Blaustein, M.; Srebrow, A. and Kornblihtt, A.R. IUBMB Life (2003), 55: 235-241. Regulation of fibronectin alternative splicing by a basement membrane-like extracellular matrix. Srebrow, A.; Blaustein, M. and Kornblihtt, A.R. FEBS Letters (2002), 514: 285-289. Trabajos publicados 5 Abreviaturas: Actinomicina D, ActD; AKT/Proteína quinasa B, AKT/PKB; anti-fosfo-AKT/PKB, pAKT; anti-fosfo-ERK, pERK; anti-fosfo-JNK/pkb, pJNK; anti-fosfo-p38, pp38; immunoglobulin heavy chain binding protein, BiP; CDC-like kinase, Clk; cicloheximida, CHX; cloranfenicol acetiltransferasa, CAT; dimetilsulfóxido, DMSO; DNA copia, cDNA; dominio carboxiterminal rico en serinas y argininas, dominio RS; dual-specificity tyrosine kinase-7, CRKRS; enhanced chemiluminiscence, ECL; enhanced green fluorescent protein, EGFP; exonic splicing enhancer, ESE; exonic splicing silencer, ESS; extra domain I, EDI; extra domain II, EDII; factor auxiliar de U2 snRNP, U2AF; factor de crecimiento de fibroblastos ácido, aFGF; factor de crecimiento de fibroblastos básico, bFGF; factor de crecimiento de hepatocitos/factor de scatter, HGF/SF; factor de crecimiento de queratinocitos, KGF; factor de crecimiento epidermal, EGF; factor de crecimiento transformante-beta1, TGF-β1; factor de crecimiento, FC; factor de iniciación de la traducción eucariota 4F, eIF4F; fibronectina, FN; fosfatidilinositol 3-quinasa, PI(3)K; glutatión-S-transferasa, GST; interferencia por RNA, RNAi; internal ribosome entry site, IRES; intronic splicing enhancer, ISE; intronic splicing silencer, ISS; isoelectroenfoque, IEF; isopropil-β-tiogalactopiranósido, IPTG; luciferasa, LUC; LY 294002, LY; mammalian target of rapamycin, mTor; MAPK quinasa, MAPKK, MKK o MEK; MAPKK quinasa, MAPKKK o MEKK; matriz extracelular, MEC; medio condicionado por células mesenquimales, MCmes; motivo de reconocimiento del RNA, RRM; open reading frame, ORF; Orto-nitro-fenilgalactopiranósido, ONPG; partícula ribonucleoproteica nuclear pequeña, snRNP; PD 98059, PD; polinucleótido quinasa, PNK; proteína quinasa activada por estrés, SAPK; proteína quinasa activada por mitógeno, MAPK; proteína quinasa C, PKC; proteína quinasa dependiente de Ca2+/calmodulina, CaMK IV; proteína rica en serina/arginina, proteína SR; quinasa de proteínas SR, SRPK; quinasa N-terminal de c-jun, JNK; quinasa regulada por señales extracelulares, ERK; reacción en cadena de la polimerasa, PCR; receptor tirosina quinasa, RTK; retrotranscripción, RT; ribonucleoproteína heterogénea nuclear, hnRNP; RNA mensajero, mRNA; RNA nuclear pequeño, snRNA; RNA polimerasa, Pol II; polypyrimidine-tract-binding protein, PTB; RNA precursor, premRNA; sitio de splicing, ss; small interfering RNA, siRNA; transportador catiónico de aminoácidos, cat1; type III connecting segment, IIICS; virus de la hepatitis C, HCV; virus de la leucemia murina de Moloney, MMLV; α-globina humana, α-gb. Abreviaturas 6 “(…) y aun siendo bellos tanto el conocimiento como la verdad, si estimamos correctamente el asunto, tendremos a la Idea del Bien por algo distinto y más bello que ellas. Y así como dijimos que era correcto tomar a la luz y a la vista por afines al sol, pero que sería erróneo creer que son el sol, análogamente ahora es correcto pensar que ambas cosas, la verdad y la ciencia, son afines al Bien, pero sería equivocado creer que una u otra fueran el Bien, ya que la condición del Bien es mucho más digna de estima.“ Platón, República 508e – 509a Finalmente, llego hasta acá con tanto por agradecer y, a cambio, tan sólo esta tesis. Pensaba durante la escritura de mi tesis de licenciatura y pienso igual ahora, al finalizar mi tesis de doctorado, que no hay cosa más linda en el proceso de redacción de una tesis que la de agradecer a todos aquellos que tuvieron que ver con el desarrollo de una etapa de la vida, que la de compartirla con ellos. Sin esa compañía, sin esa ayuda, jamás podrían haber existido esos, a veces pocos y a veces muchos, momentos de alegría. Equivocándome mucho, tropezando a cada pasito, fracasando casi con obstinación, he tratado de empezar a devolver, de comenzar a compartir al menos parte de todo lo mucho que me dieron. Habiendo sido transparente y sincero, quizás también torpe e inoportuno a la hora de explicitar lo que me ha gustado y lo que me ha disgustado en cada uno de esos otros, los no uno que han estado a mi lado, habiendo esperado lo mismo a cambio, me propongo aquí destacar esas cualidades que hacen únicas, que engrandecen a cada una de estas personas que estuvieron cerca, esas cualidades que, por lo menos a mí, me sirvieron para ser un poco más feliz. Estoy en deuda. Acaso me alcancen todos los días por venir para devolver tanta generosidad, tanto cariño. Agradecimientos 8 El acceso a las páginas 9 a 16 fue restringido a pedido del Autor. Acces to pages 9 to 16 has been restricted on Autor´s request. A mi vieja, con todo mi corazón y más. No me queda claro por dónde andarás, si te llegarán estas palabras. A resolver tan hondo misterio no han llegado las pipetas ni los microscopios de laboratorio alguno. Tuyas las palabras, allá por principios del 2004 “Si la ciencia es el leit motiv de tu vida, adelante, pero no te olvides de los que te rodean”. Mío es ese desafío. Dedicatoria 17 El acceso a la página 18 fue restringido a pedido del Autor. Acces to page 18 has been restricted on Autor´s request. ÍNDICE INTRODUCCIÓN 22 I. Regulación post-transcripcional de la expresión génica: papel del splicing alternativo 23 1. Control transcripcional y post-transcripcional 2. Splicing 3. Splicing alternativo II. Factores de splicing 1. Los actores principales 2. Estructura y función 3. Actividades citoplasmáticas de las proteínas SR III. Señales extracelulares y vías de transducción de señales 1. Factores de crecimiento (FC) y transducción de señales 2. Vías de transducción de señales y splicing alternativo 3. Quinasas y fosfatasas de proteínas SR: papel en la transducción de señales IV. El gen de la fibronectina (FN) 23 23 25 27 27 28 31 32 32 34 36 37 1. Estructura y función 2. Splicing alternativo 3. EDI 4. EDII 5. IIICS 37 39 40 42 44 V. Antecedentes del grupo 44 OBJETIVOS 50 MATERIALES Y MÉTODOS 52 I. Cultivo de células 53 1. Líneas celulares y medios 2. Tratamientos 53 54 II. Plásmidos, RNAs pequeños de interferencia (siRNAs) y transfecciones 55 1. Plásmidos 2. Preparación de plásmidos en gran escala 55 58 3. Construcción de pEDB-9G8 y pEDB-9G8as 4. siRNAs 5. Transfecciones 59 62 62 III. Detección de las isoformas de splicing alternativo 64 1. Extracción de RNA 2. RT-PCR 3. Análisis de los productos de PCR 64 65 65 4. Protocolos de PCR utilizados 66 IV. PCR en tiempo real 68 V. Separación de las fracciones nuclear y citoplasmática 68 VI. Separación de proteínas y análisis por western blot 69 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida unidimensional 2. Electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional 3. Western blot 4. Protocolos de PCR utilizados 69 69 70 34 VII. Inmunofluorescencias y microscopía 71 VIII. Ensayos de fosforilación in vitro 71 1. Expresión y purificación de proteínas recombinantes 2. Ensayos de fosforilación in vitro IX. Ensayos LUC, β-galactosidasa y CAT 1. Obtención de extractos celulares 2. Detección de la actividad LUC 3. Detección de la actividad β-galactosidasa 4. Detección de la actividad CAT 71 72 73 73 73 73 74 RESULTADOS 75 I. Regulación del splicing alternativo de FN en respuesta a FC 76 1. Análisis de la regulación de las regiones alternativas del mRNA de FN 2. Papel de la estabilidad del mRNA y de la síntesis de nuevas proteínas 3. Exportación de los mRNAs de FN II. Vías de transducción de señales 1. Fosforilación de los componentes de las cascadas de señalización 2. Bloqueo de las cascadas de señalización 76 77 79 80 80 80 2. Sobre-expresión de componentes de las cascadas de señalización III. Papel de las proteínas SR 1. Knock-down de proteínas SR 2. El ESE de 9G8 como elemento de respuesta a FC 3. Fosforilación de las proteínas SR 4. Quinasas de proteínas SR 5. AKT/PKB es una quinasa de proteínas SR IV. Regulación de la traducción 1. Regulación de la traducción por FC en forma dependiente de proteínas SR 2. SF2/ASF regula la traducción alternativa de reporteros bicistrónicos 3. Correlación entre la capacidad de SF2/ASF de regular el splicing alternativo y la de alterar la traducción alternativa 4. SF2/ASF regula la traducción alternativa de genes endógenos 83 86 86 88 88 89 91 91 91 95 98 101 DISCUSIÓN 103 BIBLIOGRAFÍA 116 INTRODUCCIÓN I. Regulación post-transcripcional de la expresión génica: papel del splicing alternativo 1. Control transcripcional y post-transcripcional Durante las últimas dos décadas, se ha vuelto ampliamente aceptado que las células interactúan con su microambiente de un modo dinámico y que esta interacción conlleva efectos profundos en su patrón de expresión génica, conduciendo a un balance apropiado entre los programas de proliferación, diferenciación y apoptosis. Es sorprendente que, pese a compartir el 98,7% de su secuencia genómica, el ser humano y su pariente evolutivo más cercano, el chimpancé, difieran en tantos aspectos comportamentales y cognitivos. Las similitudes observadas en el transcriptoma y en el proteoma de leucocitos e hígado de ambos organismos refleja esta proximidad y, sin embargo, es al comparar los patrones de expresión en el cerebro que se encuentran diferencias profundas entre humanos y chimpancés (Enard et al., 2002). Esto muestra a las claras el potencial de la regulación de la expresión génica a la hora de producir diversidad. Por muchos años, el campo de la regulación de la expresión génica se ha enfocado en el control transcripcional y grandes esfuerzos fueron realizados con el objeto de comprender cómo las señales recibidas por las células son transducidas en cambios en la actividad de los factores de transcripción (Whitmarsh y Davis, 2000; Chang y Karin, 2001). Más recientemente, se ha comenzado a considerar como un elemento clave, dentro de este escenario, al control de otros pasos del metabolismo del RNA mensajero (mRNA), incluyendo el procesamiento del RNA precursor (pre-mRNA), así como también la exportación, estabilidad y traducción del mRNA (Graveley, 2001; Gingerich et al., 2004; Shin y Manley, 2004). 2. Splicing En metazoos, la mayor parte de los genes transcriptos por la RNA Polimerasa II (Pol II) sufren la eliminación de parte de sus secuencias, conocidas como intrones, y la unión de las secuencias flanqueantes, conocidas como exones. Este proceso es conocido como splicing y fue descubierto en 1977 Introducción 23 por los grupos de Philip Sharp y Richard Roberts (Berget et al., 1977; Chow et al., 1977). A medida que ascendemos en la escala de complejidad de los organismos, la proporción de genes conteniendo intrones aumenta. Por ejemplo, menos del 5% de los genes de S. Cerevisiae contienen intrones, pero alrededor del 25% de los mRNAs maduros provienen de estos genes (Ares et al., 1999). En mamíferos, la mayoría de los genes contienen intrones (Black, 2000) y el mecanismo básico de remoción de los mismos es conocido (Staley y Guthrie, 1998; Reed, 2000). El intrón es separado de los exones en los extremos 5´ y 3´, llamados sitios de splicing (ss) dadores y aceptores. El ss 5´ consiste en una secuencia corta que encaja vagamente en el consenso GURAGU (donde R es una purina). El ss 3´ consta de tres elementos: un sitio de ramificación (consenso YNYURAY, donde Y es una pirimidina y N es cualquier base); una seguidilla de pirimidinas conocida como tracto de polipirimidinas; y la secuencia final C/UAG. En base a los dos primeros nucleótidos del ss 5´ y a los últimos dos del ss 3´ es que a esta regla se la conoce como GU-AG. Estas secuencias deben ser reconocidas por el spliceosoma, un complejo macromolecular que consiste en cinco partículas ribonucleoproteicas nucleares pequeñas (small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs) y un total de al menos 45 proteínas. Los componentes de RNA son RNAs nucleares pequeños (snRNAs), U1, U2, U4, U5 y U6, ensamblados en snRNPs. Los pasos catalíticos de este proceso se han determinado en gran detalle (Hastings y Krainer, 2001; Will y Luhrmann, 2001). Inicialmente, el ss 5´ es reconocido por U1 snRNP por apareamiento de bases. A continuación, se ensambla paso a paso el spliceosoma alrededor de los sitios de splicing. El tracto de polipirimidinas es reconocido por U2 snRNP y U4/U6 y U5 snRNPs son reclutados (Fig. 1). La selección correcta de los sitios de splicing es crucial para la expresión génica (Sharp, 1994; Black, 2003). Un segundo tipo de spliceosoma actúa en una clase minoritaria de intrones transcriptos por la Pol II, obedeciendo la regla AU-AC (Tarn y Steitz, 1996). Estos casos no serán tratados en este trabajo. Introducción 24 Figura 1: Ciclo de spllicing. Los snRN NP (U1, U2, U4 4, U5 y U6) se asocian entre sí y con el RNA inm maduro en una secuencia orde enada de pasos para formar el spliceosoma. E Este complejo ribonucleopro oteico cataliza la as dos reaccion nes de transeste erificación que rresultan en el sp plicing de los exo ones (rojo claro o y oscuro) y la eliminación e del intrón (azul) en forma de lazo o lariat. 3. Splicing g alternativo La existenccia de ss déb biles que se alejan a significcativamente del sitio de recon nocimiento co onsenso perm mite que a partir p de un mismo m gen se s expresen mRN NAs con distiinta composiición de exon nes. Este pro oceso, que see denomina splicing ng alternativo o, puede teneer también lugar l cuando o existen pro oteínas que ocultaan un ss co onsenso al spliceosoma. s En la mayyor parte dee los casos Introoducción 25 conoccidos de spliccing alternativo parece hab ber una comb binación de mecanismos m de reegulación, con factores acctuando en trans y elemeentos trabajaando en cis, determ minando la proporción p f final de cada isoforma dee mRNA. En n particular, existeen secuenciass de RNA quue no constituuyen ss, pero que pueden igualmente jugar un papel crrítico influyeendo en el reconocimien r nto y uso dee ss por el ncias se deno ominan exonic e intronic spliccing enhancers aparaato de splicing. Estas secuen (ESE Es o ISEs) y exonic o intrronic splicing silencers s (ESSss o ISSs), y promueven (enhanncers) o inhiben (silencers) el e reconocim miento de exo ones por el spliceosoma s (Matllin et al., 20055). Son, por lo l general, eleementos corttos (~10 nuclleótidos) de secueencia conservvada y están n ampliamen nte distribuid dos dentro del d genoma transccripto, pudién ndoselos encontrar aislado os o en grup po. Se conocen n cuatro tiposs de splicing alternativo a (Fig. 2). En el caso de los exonees cassettes, el exón alternativo es totalmente incluido o totalmente excluiido del men nsajero madduro; en el caso de lo os exones mutuamente m excluyyentes, dos o más exo ones de un pre-mRNA A nunca son n incluidos simulltáneamente en el mRN NA; para ell caso de los l sitios acceptores 3´ altern nativos o sitio os dadores 5´ alternativoss, se observa,, además de la l exclusión o incllusión total de d un exón, suu inclusión parcial; y finalmente, para la l retención de un n intrón, se ve v que la seccuencia correespondiente al intrón passa a formar parte del de mRNA maduro (L Lynch, 2004). Figura 2: Diferentes patrones de sp plicing alternativo. Los exones están representa ados por re ectángulos y los s intrones por líneas sólidas negras. Las líneas entrec cortadas re epresentan diferrentes posibilidades de empalme. Las regiones con nstitutivas so on mostradas en e gris oscuro, las altern nativas en gris claro. Distintas isoformas de mRNA m pueden coexistir en e un mismo o tejido y en un mismo m momen nto, pueden alternarse en n su expresió ón en un tejiddo dado en distin ntos momenttos del desaarrollo o en distintas situuaciones fisiiológicas, o puedeen expresarsee en distintos tejidos de un n mismo orgaanismo. Introoducción 26 La complejidad de organismos tales como el ser humano basada en un número relativamente pequeño de genes (solamente el doble que los del gusano o la mosca, aproximadamente) es explicada mayormente por mecanismos capaces de expandir la complejidad proteómica codificada por el genoma, es decir capaces de generar múltiples proteínas a partir de un único gen. El más relevante de estos mecanismos, el que desempeña un papel dominante, es el splicing alternativo (Sharp, 1994; Maniatis y Tasic, 2002). Hoy en día, se estima que más del 70% de los genes humanos que codifican para proteínas sufren splicing alternativo de su pre-mRNA (Black, 2000; Graveley, 2001). Muchos ejemplos de alteraciones en el splicing asociadas al cáncer son atribuibles a mutaciones que crean o disrumpen splicing enhancers y silencers. Sin embargo, sólo en pocos casos ha sido probada una relación de causa-efecto (Srebrow y Kornblihtt, 2006). A pesar de que la regulación de la expresión de cada isoforma particular sea, probablemente, de excepcional importancia para el destino celular, el modo preciso por el cual el splicing alternativo es controlado en las células y en los tejidos es, al día de la fecha, tan sólo pobremente comprendido. II. Factores de splicing 1. Los actores principales En la mayor parte de los casos, los splicing enhancers y silencers ejecutan sus efectos a través de la unión específica de proteínas regulatorias tales como las proteínas ricas en serina/arginina (proteínas SR) y las ribonucleoproteínas heterogéneas nucleares o hnRNPs (Dreyfuss et al., 1993; Manley y Tacke, 1996; Graveley, 2000). Sin embargo, algunos silencers, en lugar de unirse a proteínas regulatorias, forman una estructura secundaria particular en el RNA que impide el reconocimiento de un splicing enhancer cercano por parte de las proteínas SR (Buratti y Baralle, 2004). SF2/ASF, la primera proteína SR descubierta, fue descripta por un lado como factor de splicing alternativo y denominada ASF -Alternative Splicing Factor(Ge y Manley, 1990). Por otro lado, fue caracterizada como un factor esencial de splicing y llamada SF2 -Splicing Factor 2- (Krainer et al., 1990a) y como un factor de splicing alternativo (Krainer et al., 1990b). El clonado de los cDNAs de ASF y de SF2 permitió establecer que se trataba de la misma proteína (Ge et al., Introducción 27 1991; Krainer et al., 1991). Posteriormente, se logró la purificación de SC35 y de otro grupo de proteínas de distintos PM, todas con un alto contenido de serina y arginina (Roth et al., 1991; Zahler et al., 1992). A este grupo de proteínas, que incluía a las previamente descriptas SF2/ASF y SC35, se lo denominó “familia SR”. Esta familia, que resulta esencial tanto para la ejecución como para la regulación (generalmente positiva) de la reacción de splicing, está constituida por unos doce polipéptidos conservados evolutivamente (Manley y Tacke, 1996; Graveley, 2000). El splicing también puede ser inhibido, y varias proteínas regulatorias capaces de desempeñar este papel han sido caracterizadas. La mayoría de éstas pertenece a la familia de las hnRNPs (Dreyfuss et al., 1993; Smith y Valcarcel, 2000). Éstas incluyen a la proteína hnRNP A/B, la cual bloquea los efectos de proteínas SR uniéndose a ESSs (Mayeda y Krainer, 1992). Otro represor del splicing extensivamente estudiado es la proteína hnRNP I, también conocida como polypyrimidine-tract-binding protein o PTB (Singh et al., 1995). PTB ha recibido ese nombre debido a su habilidad de unirse a secuencias ricas en polipirimidinas localizadas en la mayoría de los ss 3´, y podría funcionar bloqueando competitivamente factores positivos que reconocen estas secuencias tales como el factor auxiliar de U2 snRNP o U2AF (Ruskin et al., 1988). 2. Estructura y función Las proteínas SR (Fig. 3) están caracterizadas por una estructura modular, análoga a la de los factores de transcripción (Cáceres et al., 1997; Graveley y Maniatis, 1998). Esta estructura consiste en la presencia de un dominio carboxiterminal rico en serinas y argininas (dominio RS), que participa de las interacciones proteína-proteína (Wu y Maniatis, 1993; Kohtz et al., 1994) y también en las interacciones con el sitio de ramificación y con el ss 5´ del RNA (Shen et al., 2004; Shen y Green, 2006), y de uno o dos motivos de reconocimiento del RNA (RRM) que influyen sobre la especificidad de sustrato (Manley y Tacke, 1996). Se piensa que el dominio RS promueve interacciones con componentes de la maquinaria de splicing que contienen otros dominios RS (Fig. 4), tales como U1 70K y la subunidad pequeña de U2AF, U2AF35 (Tacke y Manley, 1999). Como se describió para el caso de SF2/ASF, además de ser requeridas para remover los intrones constitutivamente eliminados, las proteínas SR Introducción 28 puedeen regular el splicing altern nativo, tanto o in vitro com mo in vivo (Gee y Manley, 1990;; Krainer et al., a 1990b; Fu F et al., 19922; Zahler et al., 1993; Cááceres et al., 1994;; Wang y Man nley, 1995). Este E efecto ess dependientee de la conceentración de las prroteínas SR. Esto ha lleevado a prop poner que el e splicing alteernativo en mamííferos estaría determinado o por el delicaado balance relativo r de la abundancia de diistintas proteeínas de spliciing, el cual podría p variar en distintos tejidos, en difereentes momen ntos del desarrrollo, o en diistintas condiiciones fisioló ógicas. RRM R RS RS RRM RS RRM RRM RS RRM RR RMH RS RRM RR RMH RRM RR RMH RRM RR RMH RRM RR RMH RRM Z RS RS S RS RS RS Figurra 3: Proteínas s SR. En la figurra se muestran algunas a de las proteínas SR huma anas conocidas hasta la fecha, evidenciando su s estructura mo odular. RRM: motivvo de reconocim miento del RNA; RRMH: dominio con homologíía al RRM; Z: motivvo, rico en cisteíínas, capaz de unir u zinc; RS: do ominio carboxite erminal rico en serina as y argininas. Por otro lado, las pro oteínas SR migran m desdee los speckless (dominios subnuucleares que pueden funccionar como o reservorio para p ciertos factores de splicing ng, Fig. 5) a sitios de activva transcripciión. La localiización subceelular de las proteínas SR puedde ser modificada por fosfforilación (M Misteli et al., 19998; Misteli y Speector, 1998) y algunos evventos regulados de splicinng sin duda se s basan en este fenómeno f (X Xiao y Manleey, 1997; Xiaao y Manleyy, 1998; Gravveley, 2000; Bourggeois et al., 2004). El dom minio RS es también t un im mportante deeterminante Introoducción 29 de la localización subcelular de d las proteín nas SR, actuan ndo como una señal de localización nucleear al mediarr la interacciión con el reeceptor de im mportación nas SR, cono ocido como trransportina-SSR (Cáceres et e al., 1997; nuclear de proteín Lai ett al., 2001). A B Figura 4: Modelos s de acción de las proteínas SR S en el splicing dependientte de ESE. (A) M Mecanismos dep pendientes del dominio d RS. Una a proteína SR se s une a un ESE E a través de su us RRM y conta acta a U2AF y/o a U1 snRNP a travéss de su dominio o RS. La subunid dad mayor de U2AF U se une al tracto de polipirrimidinas (Py) y esto prom mueve la unión de U2 snRNP al a sitio de ramifiicación. Algunas interacciones indirectas son ffavorecidas porr el co-a activador Srm16 60, que estimula a el splicing dep pendiente de ES SE de algunos pre-mRNA p y tam mbién interactúa a con U2 snRNP. (B) Me ecanismo indepe endiente del dom minio RS. Aquí,, la principal fun nción de la prote eína SR unida a un ESE E es antagoniza ar el efecto nega ativo de una pro oteína inhibitoria a como podría ser s una hnRNP pegada a un ES SS. Esto os modelos no son s mutuamentte excluyentes, y el splicing de algunos introne es podría involu ucrar una com mbinación de esstos mecanismo os (Cartegni et al., a 2002). Un estudio o reciente (N Ngo et al., 2005) 2 apoya un modelo en el cual SF2/A ASF sería prrimeramente fosforilado en el citoplaasma por la quinasa de proteínas SR 1 (SSRPK1) en unos pocos residuos de serina preseentes en el nio RS. SF2/ASF hipofo osforilado seería entonces importado al núcleo y domin almaccenado en lo os speckles nucleares. n Laa liberación de SF2/ASF F de estos reservvorios y su reclutamiento r o a sitios dee transcripció ón activa reqqueriría una Introoducción 30 segun nda ronda dee fosforilación n, que sería llevada l a cabo por CDC-llike kinase 1 (Clk1). La defosfo orilación de SF2/ASF S es requerida r para su actividadd durante el ng del mRNA, y por lo tan nto es conceb bible que en este e punto SF F2/ASF sea splicing defossforilado por fosfatasas (H Huang et al., 2004). 2 3. Actividaades citoplassmáticas de las proteínaas SR El haber en ncontrado un n subconjuntto de proteínas SR con caapacidad de transllocar entre el núcleo y el citoplasma c en n forma dinám mica sugirió la l existencia de acctividades cittoplasmáticas en las protteínas SR (Cááceres et al.,, 1998). En coinccidencia con esta idea, fue encontrado o que algunaas de estas prroteínas SR juegan n un papel im mportante en n la exportació ón del mRNA A (Huang y Steitz, S 2001; Huan ng et al., 20033), en la estaabilidad del mRNA m (Lem maire et al., 2002), 2 en el nonsennse-mediated deecay (Zhang y Krainer, 20004), e incluso (Fig. 6) en laa traducción del mRNA m (Sanfo ord et al., 20044). Figu ura 5: Speckles s. Foto ografía de cinco o núcleos celu ulares, tomada con c el micrroscopio confoc cal de nuesstro laboratorio,, mosstrando la partic cular distrribución nuclearr en specckles de la prote eína de fusió ón fluorescente enhanced gree en fluorescent protein p (EGFP)-SF2/ASF. Introoducción 31 En particullar, SF2/ASF F estimula laa traducción de RNAs reeporteros in vivo e in vitro y estaa traducción es incrementtada por la prresencia de un u ESE que ona como sittio de unión para p esta pro oteína SR (San nford et al., 2004). 2 Se ha funcio encon ntrado que ell estado de fo osforilación de d SF2/ASF influye en suu capacidad de un nión a los mRNAs m celuulares, así co omo también n afecta su función en traducción (Sanford et al., 2005). Al inicio del presente trabajo se deesconocía si las proteínas SR estarían estiimulando el reclutamien nto del mRN NA a sitios Hasta aquí, activo os de la traduucción, la inicciación y/o laa elongación traduccional. t el meecanismo preeciso por el cual las pro oteínas SR in ncrementan la l actividad traduccional aguarrda nuevas in nvestigacioness. Splicing Figura 6: Múlltiples funcione es de las proteínas SR R. Las proteínas SR son Exportación n Núcleo reclutadas en su versión fosforilada al so de pre-mRNA. Durante el proces splicing son desfosforiladas y depositadas e en el exon junctiion complex (EJC C) para cumplir funciones f en la exportacción del mRNA, en la Citoplasma traducción y e en la estabilidad d del mismo (Huang g y Steitz, 2005 5). Traducció ón/ estabilida ad III. Señales extracelu ulares y vías de transduccción de señales 1. Factoress de crecimiento (FC) y transducció ón de señalees Existen diferentes señ ñales extraceelulares que pueden inffluir en el ontacto entree un ligando extracelular progrrama que unaa célula lleve a cabo. El co y su receptor rep percute geneerando una intrincada red de transdducción de Introoducción 32 señales que puede derivar en la proliferación, diferenciación, quiescencia o apoptosis celular. Los agentes mitogénicos como los FC tienen un profundo impacto durante el desarrollo del organismo y un papel fundamental en mantener la homeostasis tisular. La desregulación de su producción, de la cascada de señales que desencadenan, o de los genes que las mismas activan puede generar graves patologías, entre ellas el cáncer. Las proteínas quinasas activadas por mitógenos (mitogen activated protein kinases, MAPK) son enzimas evolutivamente conservadas que conectan receptores de superficie celular, por lo general receptores tirosina quinasa (RTKs) con sus blancos regulatorios dentro de las células. Las MAPK también responden a estrés químico y físico, controlando la supervivencia celular. La actividad de las MAPK está regulada a través de cascadas compuestas por i) una MAPK; ii) una MAPK quinasa (MAPKK, MKK o MEK); iii) y una MAPKK quinasa o MEK quinasa (MAPKKK o MEKK) (Davis, 1993; English et al., 1999). En mamíferos existen, clásicamente, cuatro grupos distintos de MAPK: las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK)-1/2; las quinasas Nterminales de c-jun/proteínas quinasas activadas por estrés (JNK/SAPK)1/2/3; la familia de las proteínas p38 (p38 / / / ); y ERK5. Éstas son activadas por MAPKKs específicas: MEK1/2 para ERK1/2, MKK3/6 para p38, MKK4/7 para las JNK/SAPKs y MEK5 para ERK5 (Fig. 7). Cada MAPKK puede ser activada, sin embargo, por más de una MAPKKK, aumentando la complejidad y diversidad de la señalización a través de MAPK. Presumiblemente, cada MAPKKK confiere capacidad de respuesta a distintos estímulos. Por ejemplo, la activación de ERK1/2 por FC depende de la MAPKKK c-Raf, pero otras MAPKKK pueden activar ERK1/2 en respuesta a estímulos pro-inflamatorios (Chang y Karin, 2001). Otra vía de señalización que es también activada por agentes mitogénicos, que al igual que la vía de Raf-MEK-ERK se encuentra asociada a la activación de la proteína G pequeña Ras (que se activa intercambiando GDP por GTP), y que también ha sido muy bien caracterizada es la vía de supervivencia (Potempa y Ridley, 1998). Esta vía está compuesta por la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI(3)K), por AKT/Proteína quinasa B (AKT/PKB), que resulta activada por los inositol-fosfolípidos generados por la primera, y por la proteína blanco de la rapamicina en mamíferos (mammalian target of rapamycine, mTor, Fig. 8). Introducción 33 Figura 7: Vía as de transducción n de señales de MAPK. El esq quema muestra a las principale es vías conocidas, as sí como algunoss estímulos cap paces de activa ar a cada vía (no necesariamente específicos)). La linealidad de cada vía es una simplifica ación, existe una a importante co omunicación horizontal enttre las vías representada as. A modo de ejemplo, se ha h reportado que e tanto los facto ores de crecimiento como c el estrés oxidativo son capaces de activar a Rac c1. 2. Vías de transducció ón de señaless y splicing alternativo Entree un 70% y un n 90% de loss eventos de splicing s alternaativo alteran el producto proteico resultantte (Kan et al., a 2001; Mo odrek et al., 2001). Esto os hallazgos n de que el control c del spplicing es un componente c refuerrzan la visión importante de laa regulación de la expresión génica. Es por ello o sorprenden nte que los mecan nismos que regulan el spplicing, en paarticular las vías v de transducción de señalees, no sean aún bien con nocidos; lo que q contrastaa marcadameente con el profuundo conocim miento existen nte acerca dee los mecanismos y vías in nvolucrados en el control transscripcional. Hacia la fecha de inicio o del trabajo que dio lugar a la preseente tesis se habíaan publicado o unos poco os artículos reportando cambios en n el splicing altern nativo de traanscriptos prrovenientes de distintos genes en respuesta r al tratam miento con estímulos e exttracelulares. Se S supone quue estas señaales podrían actuarr a través de vías de tran nsducción quee enviarían laa información n al núcleo. Efecttivamente, see encontró quue, en respueesta a estrés osmótico, la cascada de señaliización MKK K3/6-p38 alteera la distribuución subcelular de hnRN NP A1 y es Introoducción 34 capazz de modularr el splicing altternativo de los l transcripttos provenien ntes de una consttrucción repo ortera conten niendo secueencias del adenovirus E1A A (van der Houvven van Oorddt et al., 2000)). Por otro laado, si bien existe evideencia de quee la proteína quinasa C (PKC C), Ras y PI(33)K pueden regular el spllicing alternatiivo (Fichter et al., 1997; Smith h et al., 1997; König et al.,, 1998; Lynch h y Weiss, 20000) muy pocco se sabía, para la fecha dee inicio de este trabajo o, acerca dee los compo onentes de señaliización que median m entree la superficiie celular y la l maquinariaa de splicing nuclear. FC C Figura 8: La vía v de PI(3)K. En respuesta a la unión de un FC a un RT TK, se activa la proteína peque eña G Ras, intercambiando GDP por GTP. Esto da lugar a la activación de la vía MAPK de Raf-MEK-ERK K por un lado y a la de supervivencia de PI(3)K-AKT/PK KB-mTor, por ell otro. Estas vía as se encuentran intterconectadas (Sebolt-Leopold y English, 2006). Por su partte, algunos trrabajos señallan un papel predominan nte de la vía Raf-MEK-ER RK en la tran nsducción dee señales origginada por laa activación Ras-R de lin nfocitos T quue deviene en la regulación n del splicing alternativo a deel exón 5 de la mo olécula de sup perficie CD444 (König et al., 1998; Wegg-Remers et al., 2001). Se encon ntró que la prroteína Sam668 sería el eslaabón final dee esta vía (Figg. 9), siendo fosforilada directaamente por ERK, E interacctuando direcctamente con n el RNA y ndo a un aum mento en la in nclusión del exón alternativvo (Matter ett al., 2002). llevan Introoducción 35 Finalmente, el splicing del pre-mRNA de la proteína fosfatasa de superficie CD45 también es regulado por señales extracelulares en linfocitos T. Contrastando con lo descripto para CD44, la transducción de señales en el caso de CD45 resulta en la exclusión de un exón alternativo. Ésta parecería ser inducida por vías de transducción de señales que involucran a Ras y a PKC (Lynch y Weiss, 2000). La exclusión está mediada por un ESS ubicado hacia el extremo 5´ del exón alternativo. La funcionalidad de este ESS es independiente de un ESE que se encuentra río abajo y que activa el sitio 5´ del exón alternativo en ausencia de estímulo extracelular (Lynch y Weiss, 2001; Rothrock et al., 2003). El ESS contiene una secuencia consenso (activation responsive sequence) que se encuentra en otros exones alternativos del mensajero de CD45, como así también en exones alternativos regulados por señales extracelulares de otros genes (Rothrock et al., 2003). El ESE contiene una secuencia rica en purinas y funcionaría mediante la actividad de proteínas SR (Lemaire et al., 1999; ten Dam et al., 2000) mientras que la identidad de las proteínas represoras de splicing que participan en esta regulación era aún desconocida al inicio del presente trabajo. 3. Quinasas y fosfatasas de proteínas SR: papel en la transducción de señales Aunque se ha encontrado que varias quinasas, incluyendo la familia de SRPKs, Clks, dual-specificity tyrosine-regulated kinase (DYRKs), CRKRS (también conocida como CDC2-related protein kinase-7; CRK7), DNA topoisomerasa I y GSK-3 entre otras, son capaces de fosforilar a las proteínas SR (Gui et al., 1994; Colwill et al., 1996; Rossi et al., 1996; Ko et al., 2001; Hernandez et al., 2004), no se han descripto vías de transducción de señales activadas por estímulos extracelulares que funciones a través de estas quinasas. Más aún, la manera en que las actividades de las proteínas SR son reguladas de modo de asegurar la coordinación de sus diferentes funciones en el metabolismo del mRNA, requiere una investigación más exhaustiva. Por su parte, se ha encontrado que las proteínas fosfatasas de serina/treonina tales como PP1 y PP2A son capaces de defosforilar a varios miembros de las proteínas SR (incluyendo a SRp70, SRp55, SRp40 y SF2/ASF) y a otros factores de splicing (Mermoud et al., 1994; Boudrez et al., 2000; Chalfant et al., 2001), alterando en consecuencia el patrón de splicing de varios transcriptos. Este mecanismo parece ser el responsable de la regulación del splicing de Bcl-x en respuesta a ceramidas vía PP1 (Chalfant et al., 2002). Introducción 36 Figura 9:: Activación de e la célula T, se eñalización y re egulación del splicing s alterna ativo de CD44. La a activación de la l célula T activva a su vez la vía de Ras-Raf-M MEK-ERK. El bla anco final de esta vía es Sam6 68, que es fosfo orilado y desplaza o inhibe a hn nRNP A1 en el exón v5 de CD44,, promoviendo su s inclusión en el e mRNA. Otros s factores como o Srm160 y Brm participan n también de essta regulación. IV. El gen de d la fibro onectina (F FN) 1. Estructu ura y función n n celular en organismos o m multicelulares s involucra un u grupo de La adhesión proteínas con un amplio rango o de actividaddes de unión n. Estas macrromoléculas son secretadas s y depositadas en la vecin ndad de céluulas formanddo una red organ nizada conociida como maatriz extraceluular (MEC). Entre E las pro oteínas de la Introoducción 37 MEC, la glicoproteína de alto peso molecular, FN, es la más ampliamente distribuida y la mejor caracterizada. Además de su localización en matrices de tejido conectivo y lámina basal, la FN se encuentra en altas concentraciones en el plasma. La FN juega un papel clave en el comportamiento adhesivo y migratorio de las células. Este comportamiento está relacionado a procesos fundamentales como la embriogénesis, el desarrollo tumoral, la hemostasis, la cicatrización de heridas y el mantenimiento de la integridad tisular (Akiyama et al., 1995; Kornblihtt et al., 1996). La importancia de la FN es conclusivamente ilustrada por el efecto letal de experimentos de knockout en ratón (George et al., 1993). Existen dos formas de FN: una forma dimérica soluble que es sintetizada por hepatocitos y secretada al torrente sanguíneo (FN plasmática) y una forma dimérica o multimérica, sintetizada por fibroblastos, células epiteliales y otros tipos celulares, que es depositada como fibrillas en la MEC (FN celular). Ambas están formadas a partir de polipéptidos similares, pero no idénticos, de alrededor de 250 kDa, los cuales comparten una organización modular común consistente en unidades homólogas de 40, 60 y 90 aminoácidos, denominadas repeticiones de tipo I, II y III, respectivamente (Petersen et al., 1983). En particular, las repeticiones de tipo III aparecen en un gran número de proteínas adhesivas (tenascina, undulina, ciertos colágenos, contactina y N-CAM), así como en algunas proteínas intracelulares (titina y twitchina) y en los dominios extracelulares de varios tipos de receptores de membrana, como el de insulina y el de la hormona de crecimiento (Bork y Doolittle, 1992). Existe una única copia del gen de FN por genoma haploide tanto en humanos (Kornblihtt et al., 1983) como en ratas (Schwarzbauer et al., 1983) y ratones (George et al., 1993). El gen de FN tiene una extensión de 75 kb, contiene 50 exones y es transcripto a partir de un único promotor dando origen a un único transcripto primario. En el gen de rata, todas a excepción de una de las 12 repeticiones de tipo I y las 2 de tipo II están codificadas por un único exón cada una, mientras que 14 de las 17 unidades de tipo III están codificadas por 2 exones cada una. Las otras 3 repeticiones de tipo III (EDI, EDII y III-9) están codificadas por un único exón largo cada una (Fig. 10). La estricta correlación entre la organización intrónica/exónica y la de la proteína modular, junto a la amplia distribución de los módulos de FN en proteínas no relacionadas, refuerzan la teoría del barajado de exones (o exon shuffling) para el origen de proteínas de varios dominios (Gilbert, 1978). Introducción 38 2. Splicing g alternativo a dee la FN, de Cuando en el año 19833 se descubriió el splicing alternativo maneera independiiente por do os grupos dee investigació ón (Schwarzb bauer et al., 1983;; Kornblihtt et al., 19844), el processo era conocido como una rareza encon ntrada en unaa docena de genes g de mam mífero. Pese a los nuevos desccubrimientos,, el gen de FN F continúaa siendo un modeelo paradigmático por su fascinante complejidad c (Kornblihtt ( e al., 1996), et caractterística que llevó a Shaarp, en su discurso d com mo ganador del Premio Nobeel, a elegirlo como c ejemplo para ilustraar el valor adaptativo del barajado b de exonees y del splici cing alternativvo (Sharp, 19994). De heccho, diferentees variantes polipeeptídicas son n generadas a través de d un comp plejo patrón de splicing altern nativo en tress sitios del traanscripto priimario de FN N. Éstos son, de 5´ a 3´: EDIII (extra domaiin II), EDI (extra domain I) y IIICS (ty type III conneccting segment) (Fig. 10). Figu ura 10: Variaciones en la estrructura primaria de la FN hum mana. El esque ema muestra lass tres regiones que q pressentan splicing alternativo. Arriba se muestra el e mayor polipéptido de FN possible. Las líneass punteadas vertticales señalan los l límites entre e exones; los blo oques de color marcan los tress tipos de homología encontrad dos en esta e proteína. Se S señalan los motivos m de unión n a integrinas mejor m descriptos: RGD y LDV. ccFN: FN celular;; pFN N: FN plasmática a. Introoducción 39 La subdivisión exónica de la región IIICS da lugar, en humanos, a cinco variantes por splicing alternativo de las secuencias codificantes (Gutman y Kornblihtt, 1987), mientras que en roedores existen tan sólo tres variantes. EDI y EDII son exones que codifican para una repetición de tipo III cada uno, siendo incluidos o excluidos durante el splicing. Como consecuencia de las posibles combinaciones, existen 8 variantes posibles de FN en pollo, 12 en rata y 20 en humanos (Kornblihtt et al., 1996). 3. EDI EDI (también conocido como EDA o EIIIA) codifica para una repetición de tipo III que puede ser incluida o excluida de la FN, entre las repeticiones III-11 y III-12. La inclusión de EDI resultó ser distintiva de la FN celular y se identificó en mRNAs de fibroblastos y de otros tipos celulares, pero no de hígado, lo que es consistente con la ausencia de este exón en FN plasmática (Kornblihtt et al., 1984). In vivo, la FN EDI+ está pobremente representada en la MEC de tejidos adultos normales. Sin embargo, esta variante está sobre-expresada en tejidos con alta tasa de proliferación, como durante el desarrollo embrionario (Norton y Hynes, 1987; Vartio et al., 1987), en células de la granulosa ovárica (Colman-Lerner et al., 1999) y en condiciones patológicas de proliferación y migración, como es el caso en tumores hepáticos malignos humanos (Oyama et al., 1989), cicatrización de tejidos (ffrench-Constant et al., 1989; Kuhn et al., 1989; Brown et al., 1993; Inoue et al., 2001), fibrosis epitelial (Barnes et al., 1994) y proliferación vascular (Glukhova et al., 1989). Inclusive, se ha propuesto a EDI como marcador molecular de carcinomas hepatocelulares (Tavian et al., 1994). Además de haberse encontrado una importante correlación entre la inclusión de EDI y la proliferación celular, migración y reparación de tejidos, han surgido fuertes evidencias de una participación activa de este exón alternativo en estos procesos. En esta línea de resultados, se ha sugerido que la inclusión de este exón mediaría un cambio conformacional en la FN que resultaría en una exposición incrementada del motivo RGD en el módulo III10 (Manabe et al., 1997). Dado que este módulo contiene el principal dominio de adhesión celular de la FN, y que éste a su vez es capaz de regular la proliferación celular mediante la interacción con la integrina α5β1, EDI actuaría aumentando la unión a esta integrina en condiciones en que se necesita Introducción 40 mayor motilidad y proliferación celular. Se ha demostrado, a su vez, la importancia de EDI en la migración celular (Shimao et al., 1999) y en la progresión del ciclo celular y mitogénesis (Manabe et al., 1999). Más aún, un importante número de experimentos demuestran que EDI es biológicamente activo per se. La conversión de lipocitos en miofibroblastos, inducida por la matriz de FN depositada por células endoteliales sinusoidales provenientes de hígado fibrótico, es bloqueada por anticuerpos contra el segmento EDI y es reproducida por FN celular y por un polipéptido EDI recombinante, mientras que la FN plasmática es incapaz de promover esta conversión (Jarnagin et al., 1994). En esta última línea de evidencias, se ha demostrado también que el efecto mitogénico del medio condicionado por una línea celular de granulosa bovina, BGC-1, es inhibido por la depleción de FN EDI+ de este medio y es reproducido por un péptido EDI recombinante (Colman-Lerner et al., 1999). Se ha descripto también un papel central de EDI en la activación de la expresión de metaloproteinasas de la MEC, necesarias para la migración celular y remodelación de tejidos (Huhtala et al., 1995; Saito et al., 1999) y en la diferenciación del músculo liso (Serini et al., 1998). Estas observaciones fueron reforzadas por el hallazgo de que EDI es un ligando para las integrinas α9β1 y α4β1, confirmando un nuevo mecanismo para la regulación de la adhesión celular mediado por el splicing alternativo (Liao et al., 2002). Recientemente, han sido generados ratones incapaces de regular el splicing de EDI y fue demostrado que esta regulación es requerida para la correcta cicatrización de heridas y para una longevidad normal (Muro et al., 2003). La primera región exónica relevante en el proceso de splicing descripta en un sistema natural fue la correspondiente al exón EDI de la FN humana (Mardon et al., 1987). El exón alternativo EDI incluye una secuencia de 81 pares de bases con estructura bipartita (Mardon et al., 1987; Muro et al., 1999) que regula el uso del ss 3´ subóptimo (Fig. 11a). La disrupción de un tracto rico en purinas (GAAGAAGAC) incluido en esta región, conocido como elemento A o ESE, reduce marcadamente la inclusión de EDI in vivo (Caputi et al., 1994) e in vitro (Lavigueur et al., 1993). Se ha demostrado, asimismo, la interacción física entre proteínas SR y esta secuencia (Lavigueur et al., 1993). Más aún, el elemento A es prácticamente idéntico a la secuencia consenso para la unión de proteínas SR como SF2/ASF, 9G8 y Tra2β (Tacke y Manley, 1995; Tacke et al., 1998; Cavaloc et al., 1999). Fue a raíz de estos resultados que a este tipo de secuencias se las llamó splicing enhancers, dada su capacidad de estimular el splicing Introducción 41 de sitios débiles, y de actuar sobre sitios de splicing heterólogos (Tian y Maniatis, 1992). Se ha demostrado que la mutación del ESE de EDI bloquea la inclusión de EDI inducida por un aumento de la compactación de la cromatina, indicando que SF2/ASF y/o 9G8 son necesarias en el mecanismo que media esa respuesta (Kadener et al., 2001). Además de la secuencia ESE, el exón EDI incluye también un ESS o elemento B (CAAGG) responsable del efecto inhibitorio sobre la inclusión de EDI (Caputi et al., 1994), cuya función sería regular la conformación del RNA y por ende la exposición del ESE (Muro et al., 1999). La regulación del proceso de splicing alternativo por señales extracelulares es crucial para modificar la expresión génica durante el desarrollo y la diferenciación celular (König et al., 1998). Poco se sabe de las señales extracelulares que controlan el splicing alternativo de EDI. Entre ellas, se ha demostrado que tanto el factor de crecimiento de hepatocitos o factor de scatter (HGF/SF) como el factor de crecimiento transformante-beta 1(TGF-β1) y el factor de crecimiento epidermal (EGF) son FC capaces de estimular la inclusión de EDI en ciertos tipos celulares (Inoue et al., 1999; Shimao et al., 1999; George et al., 2000; Srebrow et al., 2002). Por otro lado, se ha encontrado que una MEC de tipo membrana basal es capaz de inhibir la inclusión de EDI en células Hep3B, observándose una paralela disminución de la proliferación celular (Srebrow et al., 2002). 4. EDII EDII (también llamado EDB o EIIIB) fue el último sitio de splicing alternativo en descubrirse en el mRNA de FN (Gutman y Kornblihtt, 1987; Zardi et al., 1987). Como EDI, EDII codifica para una repetición de tipo III que puede o no ser incluida en la FN, entre las repeticiones III-6 y III-7, y está regulado de manera específica en el desarrollo y en cada tejido. Si bien la inclusión de este exón correlaciona con la inclusión de EDI en ciertos casos, excluyéndose de la FN plasmática y de tejidos adultos e incluyéndose en condiciones patológicas y durante el desarrollo (Kornblihtt et al., 1996), existen numerosos ejemplos en que la inclusión de ambos exones no correlaciona. Los mecanismos que regulan el procesamiento de EDII parecen ser independientes de los que regulan el splicing de EDI (Barone et al., 1989; Kornblihtt et al., 1996; Lim y Sharp, 1998; Kadener et al., 2001; Srebrow et al., 2002). La secuencia Introducción 42 amino oacídica de EDII E está máás conservadaa en la evolucción de lo quue cualquier otra repetición r dee tipo III, lo cual sugieree fuertementee una funció ón biológica para este e segmentto. De cualquuier manera, si bien se haa sugerido un n papel para EDIII en la promo oción de la addhesión celullar (Chen y Culp, C 1996; Ch hen y Culp, 1998)) y en la difeerenciación de d células epiiteliales alveo olares (Arai et e al., 1997), muy poco es lo que q se sabe acerca de laa función y regulación r dee EDII. La regulaación de la inclusión i de EDII, por su s parte, se encuentra mediada m por secueencias intróniicas río abajo o de EDII (H Huh y Hynes, 1993). Estoss elementos son una u serie de 7 hexámeros (6 UGCAUG G y 1 AGCA AUG) localizaados en una región n de tan sóllo 500 basess. La deleció ón o mutación de las 4 secuencias centraales resulta en la excllusión total de este exxón en unaa línea de terato ocarcinoma que q exhibe, normalmente n e, altos niveles de inclusiión (Huh y Hynees, 1994). Esttas repeticion nes aparentem mente estimullan el uso deel ss 5´ (Fig. 11b), no sólo del intrón i río abaajo de EDII,, sino también n de exones alternativos en genes no relacio onados (Kornblihtt et al., 1996). Se ha demostrado, a suu vez, que ell splicing alterrnativo de esste exón se encueentra controlaado por SRp440 (Lim y Sharp, 1998). cuencias Figura 11: Sec génicas que controlan c el splicing de ED DI y EDII. (A) Se resalta la se ecuencia regulatoria (blo oque rayado) de EDI (rectáng gulo central) que contiene al ESE y al ESS. (B) Se muestran las repeticiones GC CATG (barras verticales) conttenidas en el intrón 3´ de ED DII (rectángulo central). Introoducción 43 5. IIICS o se han reportado, hassta la fecha, secuencias En cuanto a IIICS, no regulaatorias de spplicing. En el único repo orte donde se indaga aceerca de los mecan nismos que regulan r el spllicing alternatiivo en esta región, r se dem mostró que SF2/A ASF es cap paz de aumeentar la incllusión del exón, increm mentando la propo orción de la isoforma IIIICS-120 (Sarkissian et al.,, 1996). La in nclusión de IIICSS es más alta en todos los tejidos fetales f en co omparación con tejidos adulto os, y esta reggión es requerida para la secreción s de dímeros de FN F durante la bio osíntesis (Schw warzbauer et al., 1989; Maardon y Sebasstio, 1992). V. Anteced dentes del grupo Mediante retrotranscrip r pción seguidda de reaccción en caddena de la polim merasa (RT-P PCR) radioacctiva con primers que aparean a en los exones consttitutivos flanqqueantes a EDI o a EDIII (Fig. 12) fuue analizada la expresión de lass isoformas de d FN EDI+,, FN EDI-, FN F EDII+ y FN EDII- en n dos líneas celulaares mamarias murinas, un na epitelial y otra o mesenquuimal. Figura 12: Análisis del sp plicing alternattivo de EDI y EDII. Representa ación esquemáttica de una porción n del gen de FN. Las flechas indican la ubicaciión de los prime ers utilizados pa ara amplificar lo os mensajeros EDI+, E EDI- y ED DII+, EDII-. Experimenttos de la Draa. Anabella Srrebrow mostrraban que la línea l celular mesen nquimal, SCgg6, expresa niveles n más elevados de la isoforma EDI+ del mensajero de FN que la línea celular epitelial SCp2. Laa interacción entre estos dos tiipos celularess induce la diiferenciación de células ep piteliales, evalluada por la formaación de estructuras tridim mensionales de d tipo alveo olar, capaces de d producir proteínas de la leche. La céllulas mesenqquimales pro oducen FC, tales como HGF F/SF y KGF, cuyos recepttores se encuuentran en la membrana m dee las células Introoducción 44 epiteliales (Imagawa et al., 2002). Para evaluar si la interacción entre ambos tipos celulares podría también tener algún efecto sobre la expresión de las dos isoformas de FN estudiadas, fueron llevados a cabo experimentos de co-cultivo celular utilizando filtros de 0,4 μm de poro (“cell culture inserts”) que se insertan dentro del pocillo de cultivo y permiten el cultivo de un tipo celular sobre la superficie del pocillo y otro tipo celular sobre la superficie del filtro. De esta manera, se permitió el intercambio de factores solubles producidos por los dos tipos celulares co-cultivados pero no el contacto directo entre ambos. Se observó entonces que la presencia de células mesenquimales estimula la expresión de FN EDI+ en células epiteliales, incrementando aproximadamente cuatro veces el cociente EDI+/EDI-, comparado con el cociente observado cuando a ambos lados del filtro se cultivan células epiteliales. Contrariamente, la expresión de las isoformas EDI+ y EDI- del mRNA de FN en células mesenquimales no fue modificada por la presencia de las células epiteliales (Fig. 13a). Se estudió también si el medio condicionado por las células mesenquimales (MCmes) era suficiente para desencadenar el aumento de la expresión de la isoforma EDI+ en células epiteliales o si, por el contrario, era necesario el co-cultivo de ambos tipos celulares para generar algún tipo de retroalimentación, de intercambio dinámico entre los mismos, como lo reportado en otros sistemas (Shimao et al., 1999). Este medio condicionado produjo un aumento de la inclusión del exón EDI en células epiteliales similar al obtenido durante los experimentos de co-cultivo (Fig. 13b). Por el contrario, ni los experimentos de co-cultivo, ni los experimentos de medio condicionado alteraron el cociente EDII+/EDII-. Durante la realización de mi tesis de licenciatura, encontramos que el agregado de distintos FC recombinantes, como el FC de fibroblastos ácido (aFGF), el básico (bFGF) y el de queratinocitos (KGF/FGF-7), a un medio sin condicionar indujo también un aumento de la inclusión de EDI en células epiteliales, extendiendo los resultados publicados hasta el momento (Inoue et al., 1999; Shimao et al., 1999; Srebrow et al., 2002) que describían para esta regulación el papel de HGF/SF, el de EGF y el de TGF-β1. Introducción 45 Figurra 13: Experim mentos de co-cu ultivo y de trattamiento con medio m condicio onado. (A) Análisis por RT-PCR de la pro oporción de iso oformas de FN EDI+ y EDI- en e experimentos s de co-cultivo. Las células ep piteliales SCp2 (ep) fuero on cultivadas so obre un filtro po oroso ubicado dentro d de un po ocillo de cultivo conteniendo m medio libre de suero s SCg6 (ep/mes). (B) Las célula (ep/-)), o bien célulass epiteliales (ep p/ep) o células mesenquimales m as epiteliales fu ueron cultivvadas en pocillo os y luego de 24 4 h en medio sin s suero perma anecieron sin tra atamiento (-) o fueron tratadas s con medio o condicionado o por células epiteliales e (MCe ep) o por célula as mesenquima ales (MCmes) por 24 o 48 h. h Se muesstra el análisis por p RT-PCR de cada isoforma. Dado que las células mesenquimal m les expresabaan un elevaddo nivel de inclussión de EDII, dado que el MCmes y los FC aumentaban a el nivel de inclussión de EDII en células epiteliales, y teniendo en e cuenta quue tanto el MCm mes como ell HGF/SF gatillaban g un n cambio fenotípico en las células epitelliales generan ndo dispersiión celular (cell ( scattering)) y una pérrdida de la morfo ología epiteliial, caracterizada por la ruuptura de un niones celularres y por la pérdidda de E-cadh herina en meembrana plasm mática (Fig. 14a-f), especuulamos que la cauusa de este cambio en el patrón de d splicing altternativo de las células epitelliales podía deberse a una transición ep pitelio-mesenquimal. Introoducción 46 Figura 14: La inclus sión de EDI en células epiteliiales mamarias s no está asociada con una transición epite eliomese enquimal. (A) La as células epite eliales SCp2 mu uestran una típic ca morfología ep plitelial cuando son plaqueadas s en plásticco pero resultan n dispersadas (ccell scattering) luego del tratam miento con HGF/SF (B) o MCmes (C). (D-F) Inmun nofluorescencia de células epite eliales en cultivo. La proteína de d membrana E-Cadherina E es mostrada en ve erde (FITC C) y los núcleos celulares en rojo (ioduro de pro opidio). Los grupos de células SCp2 muestran n una localizació ón de E-Cad dherina en los contactos c célula a-célula. Esta disstribución es pe erturbada por tra atamiento con H HGF/SF (E) o MCmes M (F). (G G-J) Doble inmu unofluorescencia contra citoque eratinas (rojo, Cy5) C y vimentina a (verde, FITC) en células epite eliales (H) y epitelialess tratadas con HGF/SF (G), mesenquimales m H (I) o MC Cmes (J) por 24 4 h. Barras: (A-C C) 250 μm; (D-F F) 30 μm; (G G-J) 75 μm. Introoducción 47 Sin embargo, el análisis de marcadores fenotípicos como la expresión de citoqueratinas (marcador epitelial), vimentina (marcador mesenquimal), y de diferentes isoformas de splicing alternativo del receptor 2 de FGF evidenciaron que, por lo menos a los pocos días del tratamiento, no existe tal transición (Fig. 14g-j y datos no mostrados) indicando que el cambio en el splicing de EDI no es el resultado trivial de esta transición o bien, alternativamente, que este cambio es un marcador temprano de una potencial transición epitelio mesenquimal. Experimentos posteriores de mi tesis de licenciatura mostraron que la regulación del splicing de EDI por MCmes y por FC recombinantes era reproducible en las células epiteliales mamarias EpH4 y en las células Hep3B. Este efecto se observó también en un minigen de EDI transfectado transitoriamente (Fig. 15), demostrando que para el aumento de la inclusión inducido por FC o bien por el MCmes es suficiente con la presencia del exón alternativo (y de sus intrones y parte de sus exones flanqueantes) y la región promotora de FN -220/+44. Por otro lado, dado que el estado de la cromatina en este plásmido es diferente al del gen endógeno, estos efectos parecen ser independientes del grado de organización basal de la cromatina. El MCmes, por su parte, no fue capaz de producir ningún efecto sobre la inclusión de EDI en transcriptos provenientes de construcciones con mutaciones en el ESE o en el ESS señalando que la integridad de estas secuencias y, probablemente, la unión de proteínas SR a la región exónica regulatoria son indispensables para que el MCmes pueda ejercer el citado efecto. promotor α-globina FN α-globina Figura 15: Minigen de EDI. Diseño del minigen reportero del splicing de EDI. El uso de primers (en rojo) que anillan contra las junturas de las Transcripción y splicing secuencias de los genes α- EDI globina y FN permite obtener un producto de PCR que mRNA EDI+ corresponde a los transcriptos derivados del mRNA EDI- minigen pero no del gen endógeno de FN. Introducción 48 Finalmente, y de modo de empezar a conocer las vías de transducción activadas por FC que participan en la regulación del splicing alternativo de FN EDI, mi tesis de licenciatura concluyó con la realización de ensayos de luciferasa (LUC) con sistemas reporteros que responden a las cascadas de transducción de señales de ERK1,2, JNK y p38. Para ello, las células fueron cotransfectadas con un vector que codifica para la enzima LUC bajo las órdenes de un promotor mínimo conteniendo secuencias de unión de GAL4 (pG5-Luc) y construcciones que expresan proteínas de fusión GAL4-ELK1 o bien GAL4ATF2, capaces de activar la transcripción cuando ELK-1 o ATF-2 se encuentran fosforilados. La fosforilación del factor de transcripción ELK-1 está asociada a la activación de la vía Ras-Raf-MEK-ERK1,2. Sin embargo, también JNK y p38 son capaces de activar este factor de transcripción (Yordy y MuiseHelmericks, 2000). Por su parte, ATF-2 es activado por JNK y p38, pero no directamente por ERK1,2. Los FC fueron capaces de activar el sistema GAL4ELK1 fuertemente y el sistema GAL4-ATF2 débilmente. Estos resultados señalaron, en conjunto, una importante activación de la vía Ras-Raf-MEKERK1,2 en respuesta a estos tratamientos ya que es la única vía, de las tres estudiadas, que es capaz de estimular únicamente a ELK-1. Introducción 49 OBJETIVOS Nuestro grupo de trabajo está interesado en estudiar y caracterizar la influencia del microentorno celular sobre el splicing alternativo en particular y sobre los procesos de regulación de la expresión génica que generan variabilidad proteómica en general. El objetivo del proyecto en el cual está inmersa esta tesis de doctorado es el de intentar definir los componentes clave de la cascada de transducción de señales que, desencadenada por la unión de un FC, determina la regulación del splicing alternativo del pre-mRNA de FN. Se intentará responder los siguientes interrogantes: I. ¿Cómo afectan los FC el patrón completo de isoformas de FN (regiones alternativas EDI, EDII y IIICS)? ¿Obedecen estos cambios en el patrón de isoformas a una regulación del splicing alternativo, a la estabilidad diferencial de cada una de las isoformas y/o a una exportación diferencial de las mismas al citosol? II. ¿Qué vías de transducción de señales son activadas por FC? ¿Cuáles vías de transducción de señales están involucradas en la regulación del splicing alternativo de FN y cuáles no? ¿Cuáles son las moléculas clave involucradas? ¿Cuáles son necesarias y cuáles son suficientes? III. ¿Cuáles son los factores de splicing involucrados en dicha regulación? ¿Cómo se modifica su actividad? IV. ¿Afecta/n esta/s vía/s de transducción de señales otros pasos en el metabolismo del mRNA de FN? Objetivos 51 MATERIALES Y MÉTODOS I. Cultivo de Células 1. Líneas celulares y medios Fueron utilizadas distintas líneas celulares mamarias murinas cedidas por la Dra. Mina Bissell (LBNL, University of California, Berkeley, Estados Unidos): SCg6 (línea mesenquimal, queratina-negativa y vimentina-positiva), SCp2 y EpH4 (líneas epiteliales, queratina-positivas y vimentina-negativas). SCp2 y SCg6 son líneas derivadas de la cepa heterogénea CID9 (Schmidhauser et al., 1990; Desprez, 1993), mientras que EpH4 es una línea derivada de la cepa heterogénea IM-2 (Reichmann et al., 1989; Hirai et al., 1998). Estas líneas fueron mantenidas en medio Dulbecco´s modified Eagle´s medium-F12 (DMEM-F12, Invitrogen) (1:1) conteniendo 2% (v/v) suero fetal bovino inactivado por calor, insulina (5 µg/ml, Sigma) y antibiótico gentamicina (50 µg/ml, Invitrogen), y fueron repicadas cuando alcanzaron una subconfluencia aproximada del 80%, mediante la tripsinización con 0,05% tripsina pancreática (Invitrogen). Además, fueron utilizadas las líneas Hep3B (línea de tipo epitelial derivada de hepatoma humano), HeLa (línea de tipo epitelial derivada de un carcinoma cervical humano), COS-7 (línea fibroblástica transformada derivada de riñón de mono verde africano) y HEK293T (línea fibroblástica transformada derivada de riñón embrionario humano), las cuales fueron mantenidas en medio DMEM (conteniendo alta glucosa en el caso de las últimas tres líneas celulares y conteniendo piruvato de sodio sólo en el caso de la línea HEK293T) conteniendo 10% (v/v) suero fetal bovino inactivado por calor, y penicilina/estreptomicina (100 unidades/ml y 100 μg/ml respectivamente, Invitrogen) y fueron tripsinizadas con 0,25% tripsina pancreática cada 3 días aproximadamente. Para la mayor parte de los experimentos se trabajó con las líneas SCp2 y Hep3B con resultados similares. Muchos de los experimentos fueron reproducidos en células EpH4 y HeLa. Los experimentos de interferencia por RNA (RNAi) fueron mayormente llevados a cabo en células Hep3B o también en HeLa para el análisis de la expresión de FGF-2. Las líneas COS-7 y HEK293T fueron utilizadas para sobre-expresar grandes cantidades de AKT/PKB y mutantes. Para el análisis de la traducción del mRNA de FGF-2 se utilizaron células HeLa dado que expresan abundante cantidad de esta proteína. Todas las células fueron mantenidas en estufa a 37ºC con 5% de CO2. Materiales y Métodos 53 2. Tratamientos • Medio condicionado y FC Para la obtención de medio condicionado, 1,3 x106 células “donantes” (SCg6, SCp2 o EpH4) fueron plaqueadas en placas de 100 mm de diámetro. Luego de 24 h, las células fueron lavadas dos veces con medio sin suero y condicionaron 10 ml de medio libre de suero por 24 h. El medio condicionado de esas primeras 24 h fue colectado y centrifugado para eliminar restos celulares (máxima velocidad, en centrífuga Rolco 2036). Las células donantes condicionaron otros 10 ml de medio por las subsiguientes 24 h. El sobrenadante de cada centrifugación fue utilizado para tratar a las células “receptoras”. Los efectos inducidos por este sobrenadante se deben a los factores en él disueltos y no a la presencia de células en el mismo ya que los mismos resultados fueron obtenidos al filtrar el sobrenadante a través de un filtro estéril de 0,45 μm (datos no mostrados). El mismo procedimiento fue repetido 24 h más tarde, por lo que finalmente las células receptoras fueron tratadas durante 48 h con medio condicionado. La misma duración tuvieron los tratamientos realizados con FC. En paralelo, 2 x105 células receptoras (SCp2, EpH4 o Hep3B) fueron plaqueadas por pocillo en placas de 6 pocillos, en medio DMEM-F12 2% (v/v) suero (SCp2 y EpH4) o DMEM 10% (v/v) suero (Hep3B). A las 24 h las células fueron lavadas dos veces con medio sin suero y permanecieron en el mismo por 24 h, luego de lo cual fueron tratadas por 48 h con medio condicionado (con un cambio de medio luego de las primeras 24 h) o con FC (en medio DMEM-F12 sin suero) o bien dejadas sin tratar en medio DMEMF12, sin suero. Los FC utilizados fueron EGF, aFGF, bFGF, KGF/FGF-7, HGF/SF, todos de Sigma y TGF-β1, de R&D Systems. Estos factores fueron utilizados en concentraciones de 20 ng/ml. • Tratamiento con inhibidores farmacológicos de vías de señalización Las células fueron pre-tratadas con los inhibidores de MEK1, PD 98059 (PD) o U0126; con el inhibidor de PI(3)K, LY 294002 (LY); con el inhibidor de p38, SB 202190; con el inhibidor de JNK, SP 600125; o bien con Materiales y Métodos 54 vehículo (dimetilsulfóxido, DMSO) por 3 h antes de ser incubadas con el estímulo correspondiente en presencia de cada uno de los inhibidores (o DMSO como control). Todos los inhibidores utilizados son de Calbiochem. • Tratamiento con inhibidores de la transcripción y de la traducción Luego de un pre-tratamiento de 2 h con el inhibidor transcripcional, actinomicina D (Act D, Invitrogen); con el inhibidor traduccional, cicloheximida (CHX, Sigma) o con sus respectivos vehículos (DMSO y etanol), las células fueron incubadas con el estímulo correspondiente en presencia de cada inhibidor o vehículo. • Hambreado de aminoácidos Para los ensayos de inducción de estrés por ausencia de aminoácidos, 2 x105 células Hep3B fueron plaqueadas por pocillo en placas de 6 pocillos, en medio DMEM-F12 10% (v/v) suero. A las 24 h, las células fueron lavadas dos veces con PBS 1X, luego de lo cual fueron tratadas por 48 h en Krebs-ringer buffer (D-glucosa 1,8 g/L, cloruro de magnesio [anhidro] 0,0468 g/L, cloruro de potasio 0,34 g/L, cloruro de sodio 7.0 g/L, fosfato de sodio dibásico [anhidro] 0,1 g/L, fosfato de sodio monobásico [anhidro] 0,18 g/L] suplementado con 10% (v/v) suero dializado o bien con DMEM-F12 suplementado con 10% (v/v) suero dializado, como control. II. Plásmidos, RNAs pequeños de interferencia (siRNAs) y transfecciones 1. Plásmidos • Reporteros de splicing alternativo pSVEDA Tot (Caputi et al., 1994), que cuenta con la región genómica conteniendo al exón EDI, sus intrones flanqueantes y los exones flanqueantes EDI-1 y EDI+1 del gen de FN humana ligados al tercer exón del gen de la α- Materiales y Métodos 55 globina humana (α-gb). La expresión del gen quimérico α-gb/FN se halla bajo regulación del promotor de la α-gb humana. pSVEDA/FN mut (Cramer et al., 1997), idéntico al anterior pero con una región del promotor de FN conteniendo dos mutaciones puntuales que no afectan su regulación en el contexto estudiado. Este minigen y el anterior fueron utilizados con resultados similares en el estudio de la regulación por FC. pSVEDA/FN mut Δ2e (A-B+) (Cramer et al., 1999), idéntico a pSVEDA/FN mut pero con una deleción en el ESE. pEDB-FN wt (disponible en nuestro laboratorio), similar a pSVEDA/FN wt pero conteniendo al exón alternativo EDII y sus secuencias flanqueantes. pEDB-9G8, idéntico al anterior pero conteniendo la secuencia de unión de 9G8, creada por inserción de un oligo doble cadena (5´- GACAACGACGACGACTAGAA-3´) en el sitio XhoI presente en el exón EDB. Esta inserción no altera el marco de lectura. pEDB-9G8as, idéntico al anterior pero portando la inserción en orientación antisentido y que fue utilizado como control. Esta inserción no altera el marco de lectura. • Reporteros de traducción pLCS-EDA (Sanford et al., 2004), cedido generosamente por el laboratorio del Dr. J.F. Cáceres (Medical Research Council Human Genetics Unit, Western General Hospital, Edimburgo, Escocia, Reino Unido) y que cuenta con la secuencia codificante del gen de LUC a la cual se le agregó el ESE del exón EDI de FN al cual se une SF2/ASF (5´-GAAGAAGAC-3´). Esta inserción no altera el marco de lectura. pLCS-EDAmt (Sanford et al., 2004), cedido generosamente por el laboratorio del Dr. J.F. Cáceres (Medical Research Council Human Genetics Unit, Western General Hospital, Edimburgo, Escocia, Reino Unido) y que cuenta con la secuencia codificante del gen de LUC a la cual se le agregó una versión mutante del ESE del exón EDI de FN que carece, cuando es transcripta a RNA mensajero, de sitios de pegado para SF2/ASF (5´-GTTGTTGTAC-3´). Esta inserción no altera el marco de lectura. pSVCAT/cat1/LUC (Yaman et al., 2003), cedido generosamente por el laboratorio de la Dra. Maria Hatzoglou (Departments of Nutrition and Biochemistry, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, Ohio, Estados Unidos), que es un reportero bicistrónico que expresa la proteína cloranfenicol Materiales y Métodos 56 acetil-transferasa (CAT), traducida por el mecanismo canónico cap-dependiente y la proteína LUC, cuya traducción depende del internal ribosome entry site (IRES) del gen eucariota que codifica para un transportador catiónico de aminoácidos (cat1), ubicado entre medio de ambas unidades codificantes. pSVCAT/BiP/LUC (Yaman et al., 2003), cedido generosamente por el laboratorio de la Dra. Maria Hatzoglou (Departments of Nutrition and Biochemistry, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, Ohio, Estados Unidos), idéntico al anterior pero conteniendo el IRES del gen eucariota que codifica para la proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina (immunoglobulin heavy chain binding protein, BiP) en lugar del de cat1. pHPI1484 (Kalliampakou et al., 2005), cedido generosamente por el laboratorio de la Dra. Penelope Mavromara (Molecular Virology Laboratory, Hellenic Pasteur Institute, Atenas, Grecia), similar al anterior pero conteniendo un IRES del virus de la hepatitis C (HCV) en lugar del de cat1. • Plásmidos de expresión de proteínas SR Para sobre-expresar proteínas SR con la etiqueta T7 en células eucariotas fueron utilizados los plásmidos pCGT7-SF2/ASF, pCGT7-9G8, pCGT7-SC35, pCGT7-SF2/ASF ΔRS, pCGT7-SF2/ASF ΔRRM1 y pCGT7-SF2/ASF ΔRRM2 (Cáceres et al., 1997; Sanford et al., 2005), cedidos generosamente por el laboratorio del Dr. J.F. Cáceres (Medical Research Council Human Genetics Unit, Western General Hospital, Edimburgo, Escocia, Reino Unido). Para sobreexpresar proteínas SR fusionadas a EGFP fueron utilizados los plásmidos pEGFP-SF2/ASF y pEGFP-9G8 (Denegri et al., 2001), cedidos generosamente por el laboratorio del Dr. G. Biamonti (Istituto di Genetica Molecolare, Pavia, Italia). Los plásmidos utilizados para la expresión en bacterias de proteínas SR fueron pGEX-SF2/ASF, pGEX-SF2/ASF ΔRS y pGEX-9G8 (Cavaloc et al., 1999), cedidos generosamente por los laboratorios de los Dres. J. Stevenin (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS/INSERM/ULP, Estrasburgo, Francia) y J. Tazi (CNRS, Montpellier, Francia). • Plásmidos de expresión y reporteros de quinasas y proteínas de señalización celular Los siguientes plásmidos fueron cedidos generosamente por el laboratorio del Dr. Omar Coso (LFBM-IFIBYNE-CONICET-FCEyN-UBA, Materiales y Métodos 57 Buenos Aires, Argentina): para la sobre-expresión de proteínas de señalización celular fueron utilizados pCEV-Ras(V12); pCDNA3-Rac(QL) (Hochbaum et al., 2003); pCMV6-HA-AKT, pCMV6-HA-AKT KM y pCMV6-HA-AKT Myr (Ahmed et al., 1997); mientras que para medir la actividad de la vía de Ras-RafMEK-ERK1/2 y de Rac los plásmidos utilizados fueron pG5-Luc (Promega), pGal4-Elk1 y pGBDXGal4-Atf2 El plásmido pCEFL-KZ-AU5-Ras(V12C40) (Oliva et al., 2004) fue cedido generosamente por el laboratorio del Dr. J.M. Rojas (Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España). Los plásmidos pECE-Myc-Clk1/2/3 (Duncan et al., 1998) fueron cedidos generosamente por el laboratorio del Dr. J.C. Bell (Regional Cancer Centre Research Laboratories, Ottawa, Ontario, Canadá). Los plásmidos pME-HA-mSRPK1/2 (Kuroyanagi et al., 1998) fueron cedidos generosamente por el laboratorio del Dr. M. Hagiwara (Medical Research Institute, Tokyo Medical & Dental University, Japón) • Otros plásmidos Para la medición de la eficiencia de transfección, las construcciones anteriores fueron co-transfectadas con el plásmido pCMV-βgal (Promega) que expresa la enzima β-galactosidasa de E.coli a partir del promotor del gen inmediato temprano de citomegalovirus humano. El plásmido Bluescript (pBS SK+, Stratagene) fue utilizado para completar la masa de DNA a transfectar. 2. Preparación de plásmidos en gran escala En los casos en que fue necesario generar masa suficiente de plásmido para las transfecciones, fueron realizadas Maxipreps mediante el uso de columnas QIAGEN. Brevemente, 250 ml de medio LB fueron inoculados con una alícuota de bacterias conteniendo el plásmido de interés con el antibiótico correspondiente y fueron mantenidos por no menos de 20 h en agitador (Orbital Shaker, Forma Scientific). El cultivo fue trasvasado a mamaderas de 1/2 litro y fue dejado enfriar en hielo unos min. Fue centrifugado en rotor JA 14 (Centrífuga Avanti J-25, Beckman) a 6.000 x g por 15 min a 4ºC. El sobrenadante fue descartado y la mamadera fue invertida sobre papel absorbente. El pellet fue resuspendido en 10 ml de P1 (Tris-HCl 50 mM pH 7,5; EDTA 10 mM) conteniendo RNasa Materiales y Métodos 58 A (Sigma) 50 μg/ml. Luego, 10 ml de P2 (hidróxido de sodio 0,2 N; SDS 1%) fueron agregados, mezclados por inversión y esta mezcla fue mantenida por 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, 10 ml de P3 (acetato de potasio 3 M pH 5,2) a 0ºC fueron agregados, mezclados por inversión e incubados por 15 a 20 min en hielo. Este volumen fue centrifugado a 20.000 x g (rotor JA14) por 30 min a 4ºC y el sobrenadante fue filtrado por embudo con gasa. Éste fue volcado en una columna QIAGEN-tip 500 previamente equilibrada, la cual fue vaciada por gravedad. La columna fue lavada dos veces con 30 ml de buffer QC y el DNA fue eluido con 15 ml de buffer QF. El DNA fue precipitado con 0,7 volúmenes de isopropanol y centrifugado a 15.000 x g (rotor JA20). Luego, el DNA fue lavado con 5 ml de etanol 70% y centrifugado (rotor JA20) a 15.000 x g por 10 min. El sobrenadante fue descartado por volcado y el pellet fue secado al aire por 10 min. Finalmente, éste fue resuspendido en 250 μl de H20. La calidad, cantidad e identidad de los plásmidos se verificó por digestión y electroforesis en gel de agarosa. 3. Construcción de pEDB-9G8 y pEDB-9G8as El plásmido pEDB-9G8 fue creado por inserción de un fragmento correspondiente a la secuencia de pegado de 9G8, descripta en Cavaloc et al., 1999, en el sitio XhoI del exón EDB de pEDB-FN wt. La estrategia de clonado consistió en: 1) Diseñar y encargar los oligos (Invitrogen): ESE 9G8 Sitio PvuI 5´-TCGATCGTGACAACGACGACGACTAGAA-3´ 3´-AGCACTGTTGCTGCTGCTGATCTTAGCT-5´ Extremo para aparear con sitio XhoI Extremo para aparear con sitio XhoI Con estos oligos: a) Se crea el ESE para 9G8, respetando las 20 bases obtenidas por SELEX (metodología basada en la selección, amplificación, clonado e identificación de las secuencias que se unen a la proteína de interés) en Cavaloc et al., 1999. Materiales y Métodos 59 b) No se altera el marco de lectura (se inserta un total de 24 bases) c) Se disrumpe el sitio XhoI (CTGGAG). d) Se crea un sitio PvuI (CGATCG) con el objeto de mapear la orientación de la inserción. e) Se deja un extremo 5´-TCGA-3´ a ambos lados del oligo doble cadena capaz de aparearse con los extremos cohesivos de un plásmido linealizado con XhoI. 2) Resuspender los oligos en agua, fosforilar sus extremos 5´ y anillarlos. • Tratamiento de los oligos con polinucleótido quinasa (PNK) y anillado de los oligos Ambos oligos fueron mezclados de tal manera que 50 pmoles de cada oligo (800 ng totales) fueron incubados con 2 U de la enzima PNK (Invitrogen), 30 min a 37°C, en presencia de ATP 1 mM y el buffer apropiado. Luego, la enzima fue inactivada a 75ºC por 10 min y la mezcla fue dejada enfriar lentamente en baño de agua para favorecer el anillado de los oligos. 3) Digerir 10 μg de pEDB-FN wt con la enzima XhoI por 2 h a 37 h, purificar la banda correspondiente al plásmido linealizado, cuantificar la concentración de plásmido purificado en gel de agarosa por comparación con un marcador de masa y defosforilar sus extremos. • Purificación de bandas de DNA de geles de agarosa La purificación de bandas de DNA a partir de geles de agarosa fue realizada con QIAEX II Agarose Gel Extraction Protocol (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, la banda de DNA fue cortada del gel de agarosa, colocada en un tubo de 1,5 ml, al cual se le agregó 3 volúmenes de buffer QX1. Posteriormente, fue agregada la resina QIAEX II (luego de haberla resuspendido en vórtex por 30 s). Se incubó por 10 min a 50°C para solubilizar la agarosa, mezclando cada 2 min para mantener la resina Materiales y Métodos 60 en suspensión. La muestra fue centrifugada por 30 seg y el sobrenadante fue descartado. Luego de lavar el pellet con 500 μl de QX1, el mismo fue lavado dos veces con buffer PE. El sobrenadante fue descartado y el pellet fue dejado secar al aire por 15 min. A continuación, fueron agregados 20 μl de agua y el pellet fue resuspendido. Luego de centrifugar por 30 seg, el sobrenadante conteniendo el DNA fue trasvasado a un tubo nuevo. En todos los casos en los que se utilizó este protocolo, una alícuota del DNA purificado fue corrida en un gel de agarosa para verificar la correcta purificación y posterior cuantificación. • Tratamiento del vector linealizado con fosfatasa alcalina Los extremos fosfato del vector linealizado fueron removidos mediante la acción de la fosfatasa alcalina de camarón (Shrimp Alkaline Fosfatase). Fue realizada una incubación de 45 min a 37°C y luego la enzima fue inactivada por calor (15 min a 65°C). 4) Realizar la ligación, transformar la misma y chequear los clones transformantes • Ligación, transformación y chequeo Para la reacción de ligación se realizó el correspondiente control sin la enzima Ligasa (Invitrogen), el control con la enzima, pero sin inserto y dos tubos (I y II) con diferentes relaciones molares inserto-vector, 3:1 y 50:1, todo en presencia de rATP 1 mM y buffer de ligasa. Los diferentes tubos fueron dejados toda la noche a temperatura ambiente y al día siguiente su contenido fue utilizado para transformar bacterias competentes (Sambrook y Russell, 2001), utilizando para ello bacterias E.coli de las cepas DH5α previamente procesadas según el método de Hanahan (Hanahan, 1983). Posteriormente, fueron chequeados los clones transformantes mediante preparación de plásmidos en pequeña escala (miniprep) y por medio de dos PCRs para cada clon, con un primer 5´ que anilla con en el exón EDB río arriba de la inserción (EDB For, 5´- Materiales y Métodos 61 GGTACCGCATCACAGTAGTTGCGGCA-3´) y utilizando como 3´ cada uno de los dos oligos con que se realizó la inserción. Los productos fueron corridos en geles de agarosa 2% y los clones positivos pEDB-9G8 y pEDB-9G8as fueron identificados por originar producto del tamaño correspondiente en una PCR y no en la otra (y viceversa). 4. siRNAs Fueron utilizados siRNAs de Invitrogen y Dharmacon con similares resultados. Los siRNAs (secuencia sentido) fueron los siguientes: si9G8, 5´-AGGAGAGUUAGAAAGGGCU(T)(T)-3´; siSF2/ASF, 5´-CCAAGGACAUUGAGGACGU(T)(T)-3´; siSC35, 5´-UCGCCUUCGUUCGCUUUCACGACAA-3´. Como control fueron utilizados siRNAs no relacionados o plásmidos vacíos. En todos los cosas fueron agregados 40 pmol de siRNA por pocillo de 35 mm en las transfecciones con Lipofectamina y 100 pmoles de siRNA por pocillo de 35 mm en las transfecciones con Lipofectamina 2000. 5. Transfecciones Las transfecciones celulares fueron realizadas con los reactivos FuGENE 6 (Roche) en el caso de las líneas celulares mamarias y Lipofectamina o Lipofectamina 2000 (Invitrogen) en el caso de las demás líneas celulares (el último reactivo se utilizó solamente para realizar la depleción de SF2/ASF por RNAi previa a los análisis de FGF-2). • FuGENE 6 Por pocillo (35 mm) de placa de 6 pocillos a transfectar, fueron mezclados (en tubos eppendorf) 97 μl de medio sin suero y sin otros agregados y 3 μl de FuGENE 6. Fueron agregados 2 μg de DNA total. El contenido fue mezclado suavemente y fue incubado por 15 min a temperatura ambiente. Finalizado dicho período de tiempo, la mezcla fue agregada de a gotas al pocillo conteniendo 2 ml de medio 1% (v/v) suero con insulina o medio sin suero con insulina y a las 24 h, el pocillo fue lavado dos veces con medio sin suero y el tratamiento correspondiente fue aplicado. En el caso de placas de 24 pocillos, Materiales y Métodos 62 todos los valores (masas y volúmenes) fueron los correspondientes a la quinta parte de los utilizados en placas de 6 pocillos. • Lipofectamina Por pocillo (35 mm) de placa de 6 pocillos a transfectar, fueron mezclados (en eppendorf o tubos de poliestireno) 100 μl de medio sin suero y sin otros agregados, y 2 μg de DNA total. En otro tubo de poliestireno fueron mezclados, por pocillo, 100 μl de medio sin suero y sin otros agregados y 6 μl de Lipofectamina. Luego, el contenido de ambos tubos fue mezclado suavemente e incubado por 40 min a temperatura ambiente. Durante este tiempo, las células fueron lavadas con PBS 1X y el medio fue reemplazado por 0,8 ml de medio fresco sin suero y sin antibióticos. Luego de mezclar, la solución de DNA y Lipofectamina fue introducida, de a gotas, en cada pocillo. Las células permanecieron durante 5 h a 37ºC en este medio, luego de lo cual este último fue reemplazado por el medio correspondiente. En el caso de placas de 24 pocillos, todos los valores (masas y volúmenes) fueron los correspondientes a la quinta parte de los utilizados en placas de 6 pocillos. • Lipofectamina 2000 Por pocillo (35 mm) de placa de 6 pocillos a transfectar, fueron mezclados (en eppendorf o tubos de poliestireno) 250 μl de medio de cultivo Optimem (Invitrogen) y 100 pmoles de siRNA. En otro eppendorf o tubo de poliestireno fueron mezclados, por pocillo, 250 μl de medio Optimem y 5 μl de Lipofectamina 2000. Cada tubo se incubó a temperatura ambiente por 15 min. Luego, el contenido de ambos tubos fue mezclado suavemente e incubado por otros 15 min a temperatura ambiente. Durante este tiempo, las células fueron lavadas con PBS 1X y el medio fue reemplazado por 2 ml de Optimem. La solución fue introducida, de a gotas, en cada pocillo. Las células HeLa permanecieron durante 24 h a 37ºC en este medio antes de cambiarlo por el medio correspondiente a cada línea celular. Materiales y Métodos 63 III. Detección de las isoformas de splicing alternativo 1. Extracción de RNA El medio de cultivo fue aspirado y 500 μl de solución desnaturalizante (Isotiocianato de guanidinio 4 M, Citrato de sodio 25 mM, β-mercaptoetanol 0,1 M y N-laurilsarcosina 0,5%) fueron agregados por pocillo, en placas de 6 pocillos. En los casos en que los tratamientos generaron muerte celular, los pocillos fueron lavados con medio de cultivo sin suero previo al agregado de solución desnaturalizante de modo de eliminar restos celulares en suspensión. La solución fue trasvasada a tubos eppendorf y 50 μl de acetato de sodio 3 M pH 4 fueron agregados por tubo. El contenido fue mezclado por inversión y 500 μl de fenol:H2O fueron agregados y mezclados. Posteriormente, 120 μl de cloroformo:isoamílico (49:1) fueron agregados. El contenido fue mezclado con ayuda de un vórtex durante 10 seg e incubado 30 min en hielo. Posteriormente, fue centrifugado 30 min a 10.000 RPM (9.300 x g, centrífuga refrigerada 5415 R, Eppendorf) a 4°C. La fase acuosa fue trasvasada a otro tubo eppendorf y precipitada con un volumen de isopropanol 100% durante al menos 60 min a -20°C. Luego, fue centrifugada 30 min a 10.000 RPM a 4°C. El sobrenadante fue volcado y fueron agregados 300 μl de etanol 75%. Para desprender el pellet de la pared del tubo, fue utilizado un vórtex y, posteriormente, fue realizada una centrifugación de 10 min a 10.000 RPM (9.000 x g). El sobrenadante fue descartado y el pellet secado al aire. Finalmente, este último fue resuspendido en H2O libre de RNasas y guardado a -80°C (Chomczynski y Sacchi, 1987; Sambrook y Russell, 2001). Previamente a la síntesis del DNA complementario, la calidad y cantidad de RNA fue chequeada en geles de agarosa al 1% corridos a 5 V/cm en TBE 1X (ácido bórico 89 mM, Tris 89 mM y EDTA 20 mM, en TBE 10X) teñidos con bromuro de etidio. Materiales y Métodos 64 2. RT-PCR • Síntesis de DNA copia (cDNA) a partir de RNA de células en cultivo Para sintetizar cDNA a partir del RNA extraído, el RNA contenido en un volumen de 5 μl fue desnaturalizado a 65°C por 5 min, transferido a 0°C, y luego fue mezclado con 15 μl de Tris-HCl pH 8,3 50 mM, cloruro de potasio 75 mM, cloruro de magnesio 3 mM, DTT 10 mM, RNAsin 20 U (Promega), dNTPs 400 μM, pdT12.18 2,5 μM (Pharmacia) y transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT, Invitrogen) 300 U. Los tubos fueron incubados a temperatura ambiente durante 10 min, luego a 35°C durante 1 h y a 95°C por 5 min. Fueron incluidos siempre controles sin RNA. • Amplificación de cDNA por PCR Las reacciones de amplificación fueron realizadas según las indicaciones del proveedor utilizándose 1,5 mM de cloruro de magnesio, 200 μM dNTPs y 1,5 unidades de Taq Polimerasa (Invitrogen) en todos los casos. Como molde fue utilizado un 10% (2 μl) de la reacción de síntesis de cDNA. Los primers fueron utilizados en una concentración de 1 μM final cada uno. En los protocolos en que se especifica, fue agregado DMSO 3% (v/v) para eliminar bandas espurias y fueron agregados 0,1 μCi de [32P-α] dCTP por tubo en las PCRs radioactivas. Siempre fueron incluidos controles sin cDNA molde. La amplificación fue realizada en un termociclador modelo PTC-100 (MJ research, Inc.). 3. Análisis de los productos de PCR Los productos de amplificación fueron analizados de las siguientes maneras: -en geles de agarosa al 1-1,5% en TBE 1X, teñidos con bromuro de etidio. La electroforesis fue realizada a un voltaje constante de 5V/cm. -en geles de poliacrilamida 6% nativos en TBE 1X. La electroforesis fue realizada a una potencia constante de 15W. En este último caso, los productos fueron visualizados gracias a la inclusión de [α32P] dCTP en la PCR. Esto Materiales y Métodos 65 permitió, además, cuantificar la proporción de cada isoforma de splicing. Para ello, el gel fue deshidratado en una secadora modelo 583 (Bio-Rad), fue realizada una autoradiografía, el gel y la autorradiografía fueron superpuestos y las bandas correspondientes a cada isoforma estudiada fueron recortadas. Finalmente, la radioactividad de cada banda fue cuantificada en un contador de centelleo LS 6500 (Beckman) por el método de Cerenkov. 4. Protocolos de PCR utilizados • FN EDI endógeno de ratón Fueron utilizados los oligonucleótidos mFNdir y mFNrev (Werbajh et al., 1998). La amplificación fue realizada del siguiente modo: Un primer paso de desnaturalización a 94ºC por 5 min, seguido de 30 ciclos de: Desnaturalización: 94°C por 1 min. Apareamiento: 63°C por 1 min. Elongación: 72°C por 1 min. Un paso de elongación final de 5 min a 72ºC. • FN EDI endógeno humano Fueron utilizados los oligonucleótidos hFN-dir4860 y hFN-rev5758 (Srebrow et al., 2002). Fue utilizado DMSO. La amplificación fue realizada del siguiente modo: Un primer paso de desnaturalización a 94ºC por 3 min, seguido de 26 ciclos de: Desnaturalización: 94°C por 1 min. Apareamiento: 62°C por 1 min. Elongación: 72°C por 2 min. Un paso de elongación final de 10 min a 72ºC. • Minigen EDI Fueron utilizados los oligonucleótidos pSV5’j y pSV3’j (Caputi et al., 1994). Fue utilizado DMSO. La amplificación fue realizada durante 30 ciclos del siguiente modo (Cramer et al., 1997): Materiales y Métodos 66 Desnaturalización: 94°C por 45 seg. Apareamiento: 63°C por 1 min. Elongación: 72°C por 30 seg. • FN EDII endógeno de ratón Fueron utilizados los oligonucleótidos hEDB-dir (la secuencia humana guarda 100% de identidad con la murina) y mEDB-rev (5´CAGTGGA CAGTGAATGAGTTGG 3´) (Srebrow et al., 2002). La amplificación fue realizada del siguiente modo: Un primer paso de desnaturalización a 94ºC por 3 min, seguido de 30 ciclos de: Desnaturalización: 94°C por 1 min. Apareamiento: 63°C por 1 min. Elongación: 72°C por 1 min y 40 seg. Un paso de elongación final de 5 min a 72ºC. • FN EDII endógeno humano Fueron utilizados los oligonucleótidos hEDB-dir y hEDB-rev (Srebrow et al., 2002). La amplificación fue realizada del siguiente modo: Un primer paso de desnaturalización a 94ºC por 3 min, seguido de 30 ciclos de: Desnaturalización: 94°C por 1 min. Apareamiento: 63°C por 1 min. Elongación: 72°C por 1 min y 40 seg. Un paso de elongación final de 5 min a 72ºC. • Minigen de EDB Fueron utilizados los oligonucleótidos α23-glob (5´ CTTCAAGCTCC TAAGCCACTG 3´) y bra 2 (5´ TAGGATCCGGTCACCAGGAAGTTGGT TAAATCA 3´). Fue utilizado DMSO. La amplificación fue realizada durante 30 ciclos del siguiente modo: Desnaturalización: 94°C por 45 seg. Apareamiento: 63°C por 1 min. Materiales y Métodos 67 Elongación: 72°C por 30 seg. • FN IIICS endógeno de ratón Fueron utilizados los oligonucleótidos mIIICSdir y mIIICSrev (Chauhan et al., 2004). La amplificación fue realizada del siguiente modo: IV. Desnaturalización: 94°C por 30 seg. Apareamiento: 62°C por 30 seg. Elongación: 72°C por 60 seg. PCR en tiempo real La cuantificación de los transcriptos derivados de los plásmidos pLCS- EDA y pLCS-EDAmt fue llevada a cabo por RT-PCR en tiempo real, utilizando un DNA Engine Opticon system (Bio-Rad). Las amplificaciones fueron realizadas en cloruro de magnesio 3,5 mM y SYBR Green 1:30.000 (Molecular Probes) con una incubación inicial a 94ºC por 3 min seguida de 35 ciclos de: Desnaturalización: 94°C por 30 seg. Apareamiento: 62°C por 30 seg. Elongación: 72°C por 1 min. Los oligonucleótidos fueron descriptos previamente (Sanford et al., G&D/2004). V. Separación de las fracciones nuclear y citoplasmática Las células fueron lavadas y cosechadas en 200 μl PBS frío y luego centrifugadas a 4°C por 2 min a 2.000 RPM. El pellet fue resuspendido en 150 μl de RSB (Tris-HCl pH 7,5 10 mM, cloruro de potasio 10 mM, espermidina 0,5 mM, espermina 0,15 mM, NP40 0,1% (v/v), DTT 1 mM, y Complete protease inhibitor cocktail 1X [Roche]). Luego de 5 min de incubación en hielo, las células fueron lisadas en vórtex. Los núcleos fueron colectados por centrifugación a Materiales y Métodos 68 4°C por 10 min at 2.000 RPM, correspondiendo el sobrenadante a la fracción citosólica. VI. Separación de proteínas y análisis por western blot 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida unidimensional Luego de los tratamientos, las células fueron lisadas en 2X sample buffer (SDS 4%, glicerol 20%, Tris 120 mM, azul de bromofenol 0,002% y β- mercaptoetanol 200 mM) a los tiempos que se indican en cada caso. Las proteínas fueron separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida 10% (SDS-PAGE). 2. Electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional Luego de cada tratamiento, las células fueron lavadas con PBS frío y cosechadas en buffer de lisis (HEPES pH 7,5 20 mM, NP-40 1% [v/v], cloruro de sodio 300 mM, EGTA 10 mM, -glicerofosfato 40 mM, cloruro de magnesio 2,5 mM y vanadato de sodio 2 mM). Luego de remover los residuos celulares, 100 μg de proteína de la fracción soluble fueron mezclados con buffer de extracción SDS para llegar a una concentración final 1X (SDS 3% [p/v], glicerol 10% [v/v], Tris-HCl pH 6,8 40 mM y DTT 50 mM) y calentado a 95°C por 5 min. Para la cuantificación de proteínas, fue utilizado el ensayo de proteínas de Bio-Rad. Básicamente, 2 diluciones de cada muestra, junto con una curva de estándares de BSA (de 0,05 a 0,5 mg/ml de proteína), todas en un volumen final de 10 μl, fueron mezcladas con 200 μl de una dilución al quinto del reactivo de Bio-Rad en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente. Luego, fue determinada la absorbancia a 570 nm. La precipitación de las proteínas fue llevada a cabo agregando acetona fría e incubando la mezcla a -20ºC por 20 min. Luego de lavar con acetona 80% (v/v), el pellet fue secado en vacío (SAVANT SVC 100H). El pellet proteico fue resuspendido en 60 μl de buffer de isoelectroenfoque (buffer IEF: urea 8 M, tritón X-100 2% [v/v], mercaptoetanol 5% [v/v], anfolitos Bio-Rad Bio-Lyte 3-10 2% [v/v] y azul de bromofenol 0,01% [p/v]) por 1 h a 37ºC con agitación ocasional y centrifugado a 10.000 x g por 10 min. El sobrenadante fue sembrado en el cátodo de un gel Materiales y Métodos 69 de IEF (gradiente de pH de 3-10) y recubierto con buffer IEF 0,5X. La electroforesis bidimensional en gel fue llevada a cabo en Mini-Protean® 2-D (BIO-RAD) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La electroforesis en la primera dimensión fue desarrollada a 700 V por 6,5 h (el pre-enfoque fue omitido). Los geles de IEF corridos fueron incubados en buffer de equilibrado (SDS 3% [p/v], Tris-HCl pH 6,8 62,5 mM, EDTA 0,1 mM, glicerol 10% [v/v], -mercaptoetanol 2% [v/v] y azul de bromofenol 0,01% [p/v]) e inmediatamente congelados en hielo seco y guardados a –80ºC. Para la segunda dimensión los geles fueron cargados en un SDS-PAGE 12% (p/v) y recubiertos con buffer de equilibrado 0,5 X suplementado con agarosa 1% (p/v). 3. Western blot Luego de electrotransferir las proteínas a membranas de nitrocelulosa fue realizado el bloqueo de dichas membranas con una solución de bloqueo, leche 5% (p/v) en TBS conteniendo Tween (TTBS) 0,05% (v/v), por 1 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C. A continuación se incubó la membrana con el anticuerpo primario correspondiente en solución de bloqueo (la anteriormente descripta o bien seroalbúmina bovina [BSA] 0,5% [p/v] en TTBS) por 1 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C. Luego de 3 lavados de 5 min cada uno con TTBS se incubó la membrana con un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa en solución de bloqueo y luego de lavar se reveló por el sistema de detección enhanced chemiluminiscence (ECL). Los anticuerpos utilizados fueron: anti-fosfo-ERK (pERK), antifosfoJNK (pJNK), anti-fosfo-p38 (pp38), anti-ERK2, anti-JNK, anti-p38, anti-PKB (Santa Cruz Biotechnology, provistos por el Dr. O.A. Coso, LFBM-IFIBYNECONICET-FCEyN-UBA, Buenos Aires, Argentina) y anti-fosfo-AKT/PKB (pAKT, Cell Signalling Technology); anti-SF2/ASF (mAb 103; provisto por el Dr. A.R. Krainer, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, Estados Unidos), anti-9G8 (mAb 1C6, provisto por el Dr. J. Stevenin, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS/INSERM/ULP, Estrasburgo, Francia); anti-AU5, anti-HA y anti-Myc (Covance, provistos por el Dr. O.A. Coso, LFBM-IFIBYNE-CONICET-FCEyN-UBA, Buenos Aires, Argentina); anti-T7 (Novagen); y anti-FGF-2 (sc-79 y sc-7911, Santa Cruz Biotechnology, provistos por la Dra. C. Lanari, Laboratorio de Carcinogénesis Hormonal, Instituto de Biología y Medicina Experimental, CONICET, Buenos Aires, Argentina). Materiales y Métodos 70 VII. Inmunofluorescencias y microscopía Para los ensayos con microscopía de fluorescencia, 2 x105 células fueron plaqueadas en pocillos de 35 mm y transfectadas 24 h después con 250 ng de pEGFP-9G8 o pEGFP-SF2/ASF y 1.750 ng de pECE-Myc-Clk2, pCMV6-HA-AKT Myr o vector vacío. 48 h después las células fueron fijadas y sujetas a ensayos de inmunofluorescencia para detectar las proteínas Clk2 y AKT Myr. Las células fueron fijadas con 1 ml de paraformaldehído 4% (p/v) en PBS por 15 min a temperatura ambiente, lavadas dos veces con PBS, permeabilizadas por 5 min con 1 ml de tritón X-100 0,2% (v/v) en PBS, y luego de lavar con PBS, bloqueadas por 30 min con 1 ml de BSA 3% (p/v) en PBS. Luego de la incubación con 100 μl del anticuerpo primario (anti-HA o anti-Myc) y 100 μl del secundario (acoplado a Cy5) en solución de bloqueo y extenso lavado con PBS, la células fueron montadas con Vectashield conteniendo ioduro de propidio (Vector Laboratories). Las imágenes fueron capturadas en un microscopio confocal Olympus Fluoview FV300 equipado con un objetivo para aceite de inmersión de 60X. Para la excitación de EGFP fue utilizado el láser de argón (488 nm); para la excitación del ioduro de propidio, el láser de helio-neón verde (543 nm); y para la excitación del Cy5, el láser de helio-neón rojo (633 nm). El programa utilizado para captura de imágenes fue el Fluoview versión 3.3 (Olympus). VIII. Ensayos de fosforilación in vitro 1. Expresión y purificación de proteínas recombinantes • Proteínas de fusión glutatión-S-transferasa (GST)-SR Las proteínas de fusión GST-SR fueron sobre-expresadas en la cepa E. coli Rosetta pLysS BL21 (Novagen). Para ello, las bacterias fueron crecidas durante la noche a saturación en 20 ml de LB conteniendo los antibióticos ampicilina y cloranfenicol. A la mañana siguiente, las bacterias fueron transferidas a 500 ml de medio fresco conteniendo ampicilina, cloranfenicol y glucosa 0,2% (p/v) e incubadas a 37°C hasta que la densidad óptica fue de 0,5 (a 600 nm). Luego, fueron inducidas con isopropil- -tiogalactopiranósido Materiales y Métodos 71 (IPTG) 1 mM durante 3 h. Las bacterias fueron centrifugadas por 30 min a 3000 RPM y lisadas en solución A (PBS conteniendo tritón X-100 1% [v/v], EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, Complete protease inhibitor cocktail 1X [Roche]). Posteriormente, los lisados fueron congeladas en nitrógeno líquido y descongeladas a 37ºC dos veces y sonicadas tres veces al 50% de amplitud en tubos falcon de 15 ml. Posteriormente, los lisados fueron centrifugados a 9.000 RPM por 15 min y el sobrenadante fue mezclado con una resina de glutatiónsefarosa 4B-CL (Amersham-Pharmacia) y agitado por 60 min a 4ºC. Luego, la mezcla fue centrifugada por 5 min a 3.000 RPM, el sobrenadante descartado y el pellet resuspendido en 1 ml de solución A y transferido a un tubo eppendorf. Luego de tres lavados con solución A y de dos lavados con solución A sin tritón X-100, las proteínas de fusión mezcladas con la resina fueron guardadas a 4ºC. • Inmunoprecipitación de proteínas Para los ensayos de fosforilación de proteínas SR por AKT/PKB, 1-2 x106 células HEK293T o COS-7 fueron transfectadas en placas de 100 mm con pCMV6-HA-AKT o pCMV6-HA-AKT KM, o bien no fueron transfectadas. Luego de 48 h, las células fueron lavadas con PBS frío y lisadas a 4ºC en buffer de lisis de AKT/PKB (Tris-HCl pH 7,5 20 mM, cloruro de sodio 137 mM, tritón X-100 1% [v/v], glicerol 10% [v/v], fluoruro de sodio 20 mM, vanadato de sodio 2 mM, DTT 1 mM, β-glicerofosfato 25 mM y Complete protease inhibitor cocktail 1X [Roche]). Luego de descartar los restos celulares insolubles, los extractos fueron incubados con 1 μl de anticuerpo anti-HA (MMS-101R, Covance) por 1 h a 4ºC, luego de lo cual fueron incubados con 20 μl de Gamma-Bind sepharose beads (Santa Cruz Biotechnology) por 30 min a 4ºC. Finalmente, la mezcla fue centrifugada a 3.000 RPM por 30 seg a 4ºC y el sobrenadante descartado. Los lisados sin transfectar fueron sometidos al mismo procedimiento y utilizados como control negativo. 2. Ensayos de fosforilación in vitro Luego de extenso lavado, los inmunoprecipitados fueron incubados con 10 mCi de [γ-32P]ATP por 30 min a 25ºC en 30 ml de buffer de quinasa (HEPES pH 7,4 20 mM, cloruro de magnesio 10 mM, cloruro de manganeso 10 mM, DTT 1 mM, ATP 20 mM), utilizando 1–2 μg de proteínas de fusión GST-SR Materiales y Métodos 72 (cuantificadas por comparación contra una curva de masa de BSA en gel SDSPAGE teñido con Coomassie blue) o bien histona H2B (Santa Cruz Biotechnology) como sustrato. Las reacciones fueron terminadas por agregado de 5X sample buffer y luego fueron hervidas. La incorporación de fosfato fue analizada por electroforesis de las muestras en un SDS-PAGE 12% (p/v) y autoradiografía. Ensayos LUC, β-galactosidasa y CAT IX. 1. Obtención de extractos celulares Las monocapas fueron lavadas una vez con PBS 1X luego de lo cual, 200 μl de buffer de lisis (Reporter Lysis buffer, Promega) fueron agregados a cada pocillo. Con la ayuda de un rubber policeman, los lisados fueron trasvasados a tubos eppendorf. Estos permanecieron a -80ºC hasta la determinación de las distintas actividades. Previo a la misma, fueron centrifugados a 10.000 x g por 5 min y los sobrenadantes fueron utilizados para la medición de dicha actividad. 2. Detección de la actividad LUC Para determinar la actividad LUC fue utilizado un kit de la empresa Promega. Brevemente, 30 μl de extracto fueron mezclados con 100 μl de buffer de ensayo (Luciferase assay buffer II) en tubos de luminómetro evitando la luz directa e inmediatamente la actividad LUC fue cuantificada en un luminómetro Junior (EG&G Berthold, Bad Wilbad, Alemania) como emisión de luz durante 30 seg. 3. Detección de la actividad β-galactosidasa Un volumen de buffer β-gal 2X (Fosfato de sodio 0,2 M pH 7,4, cloruro de magnesio 2 mM, β-mercaptoetanol 0,1 M y Orto-nitro-fenil- galactopiranósido (ONPG) 1,33 mg/ml) y un volumen del sobrenadante de cada extracto centrifugado (obteniendo un volumen final de 100 μl por pocillo) fueron colocados, por pocillo, en placas de 96 pocillos e incubados a temperatura ambiente hasta desarrollo de color amarillo. La reacción fue Materiales y Métodos 73 detenida con 100 μl de carbonato de sodio 1 M por pocillo. Finalmente, la absorbancia a 415 nm fue medida en un espectrofotómetro DU Serie 500 (Beckman). 4. Detección de la actividad CAT Para evaluar la actividad CAT, 40 μl del sobrenadante obtenido a partir de los lisados celulares fueron calentados a 60°C por 10 min y mezclados en un volumen final de 100 μl conteniendo Tris-HCl pH 7,8 120 mM, 0,1 μCi de 14C-cloranfenicol y 25 μg de n-butiril CoA (Sigma), a 37°C por 2 h. El producto, cloranfenicol n-butirilado, fue extraído por agregado de 200 μl de una mezcla 2:1 de tetrametilfenilenediamina [TMPD] – xileno, mezclado por vórtex por 30 seg, centrifugado por 2 min a máxima velocidad y, finalmente, 70 μl de la fase superior fueron cuantificados con tolueno mediante un contador de centelleo. Materiales y Métodos 74 RESULTADOS I. Regulación del splicing alternativo de FN en respuesta a FC 1. Análisis de la regulación de las regiones alternativas del mRNA de FN Nuestros trabajos previos indican que un importante número de FC (EGF, bFGF, HGF/SF, aFGF y KGF), al igual que el MCmes, son capaces de estimular la inclusión del exón alternativo EDI, pero no de EDII en el mRNA maduro de FN. Para obtener el panorama completo de la regulación de las isoformas alternativas de FN, realizamos un análisis de la región alternativa IIICS. Luego de exponer a las células a diferentes estímulos por 48 h, éstas fueron colectadas y su RNA fue extraído para comparar las diferentes isoformas de splicing por RT-PCR radioactiva con primers que aparean en los exones flanqueantes a las zonas de interés (Fig. 16a). Notablemente, encontramos una fuerte correlación en la regulación del splicing alternativo de las regiones alternativas EDI y IIICS en respuesta a FC y a MCmes, a diferencia de lo observado para EDII (Fig. 16b-d y datos no mostrados). Las mismas señales que fomentaron la inclusión de EDI, estimularon la isoforma IIICS-120, que corresponde a la inclusión total de IIICS. Esta isoforma contiene un motivo LDV que es capaz de promover la adhesión celular por interacción con las integrinas α4β1 y α4β7 (Humphries et al., 1986). Por lo tanto, y dado que EDI es un ligando para las integrinas α9β1 y α4β1, esta nueva FN sintetizada tendría un potencial incrementado para unirse a un grupo de integrinas asociadas con adhesión celular, proliferación, migración e inducción de metaloproteinasas de matriz (Huhtala et al., 1995; Serini et al., 1998; Manabe et al., 1999; Saito et al., 1999; Liao et al., 2002). Esta correlación encontrada en la regulación del splicing alternativo de EDI y IIICS sugiere algún tipo de control en cis y/o en trans compartido por estas dos regiones de la FN. Por el contrario, el hecho de que el splicing alternativo de EDII no sea afectado por estos tratamientos confirma que el splicing alternativo de EDI y EDII es controlado por mecanismos moleculares diferentes (Lim y Sharp, 1998; Cramer et al., 1999; Kadener et al., 2001). A partir de aquí, a menos que se indique lo contrario, se utilizó indistintamente HGF/SF, KGF/FGF-7 o MCmes bajo el rótulo de “FC” para estimular los cambios en las isoformas alternativas de FN. Resultados 76 Figurra 16: Regulac ción del patrón de isoformas murinas de FN N por FC. (A) El E esquema mue estra las tres regiones de FN que presentan spliccing alternativo. Arriba se mues stra el mayor po olipéptido de FN N posible. Las fle echas indica an la ubicación de los primers utilizados u para amplificar a las diiferentes isoform mas. (B-D) Las células SCp2 fu ueron tratad das con FC (20 ng/ml finales) y 48 h después del tratamiento se extrajo el RN NA y se lo some etió a RT-PCR para evalu uar las isoformas de FN EDI+ y EDI- (cociente EDI+/EDI) (B), las isoformas LDV+ L (IIICS-120 0) y LDV- (IIICS S-0 y IIICS-95; cociente LD DV+/LDV-) (C), y las isoformass EDII+ y EDII- (cociente ( EDII+/EDII-) (D). Las variantes de sp plicing fuero on analizadas co omo se indica en Materiales y Métodos. M Los va alores en los hisstogramas corre esponden a la media m ± el error e estándar. Los experimenttos fueron realizzados en duplic cado siempre y repetidos r al menos dos veces. Resu ultados similaress fueron obtenid dos en células EpH4 E y Hep3B. 2. Papel dee la estabilid dad del mRN NA y de la sííntesis de nu uevas proteeínas Nos pregun ntamos entonces si los FC F actúan faavoreciendo, por splicing altern nativo, la prodducción de una u mayor proporción de mRNA contteniendo las region nes alternativvas o bien, altternativamente, alterando la estabilidadd relativa de las diiferentes isofformas de spllicing alternatiivo previameente sintetizaadas. Por lo tanto, evaluamos el efecto de los l FC en céélulas pretrataadas con el in nhibidor de la traanscripción Act A D, una situación s en la cual el ún nico modo de d alterar el patrón de isoform mas es cam mbiando la estabilidad e deel mRNA previamente p Resuultados 77 sintettizado. El perríodo de estim mulación eleggido fue suficcientemente largo como para observar o unaa regulación del d splicing alteernativo de EDI, E sin comp prometer la superrvivencia celuular por efectto de la Act D. D Luego de un tratamien nto de 16 h con FC, F el cocien nte EDI+/ED DI- aumentó ó más de un 60%, un efeccto que fue comp pletamente blloqueado por Act D (Figg. 17). Aunqque este resulltado es un argum mento de pesso en contra de la posibillidad de un cambio c en laa estabilidad del mRNA m para explicar la regulación r ob bservada, no o podemos descartar d la posib bilidad de quee la Act D esté inhibienddo la síntesis de novo de un na proteína necessaria para cam mbiar la estab bilidad relativva de ambas isoformas. i Siin embargo, obserrvamos un auumento de más m de cuatro o veces en el e cociente EDI+/EDIE cuanddo el tratam miento con FC F se realizó ó en presenccia del inhib bidor de la traducción CHX, que si bien in nhibe la sínteesis de nuevaas proteínas no n inhibe la transccripción y el splicing s de nueevos RNAs. Estos E resultaados no sólo descartan d la última hipótesis siino que demuuestran que laa regulación del splicing altternativo de FN es e independieente de la sííntesis de novvo de proteín nas y es poteenciada por CHX X. Más aún, laa Act D bloquueó totalmen nte los efectoss de los FC y CHX (Fig. 17). Notablemente, se obtuvvieron resulttados similares para loss cocientes LDV+/LDV- de IIICS en esttas condicion nes, expandien ndo la correllación entre la reggulación de EDI y IIICS aún a más (dato os no mostrad dos). Fig gura 17: La reg gulación del pa atrón de isoform mas altternativas de FN F no depende de e la estabilidad del mRNA ni req quiere síntesis s de novo de proteínas. Luego o de un tra atamiento de 2 h con Act D (5 μg g/ml) o vehículo (etanol) más CH HX (2,5 μg/ml) o vehículo (DMSO), las célullas SCp2 fueron n de ejadas sin tratam miento (barras cla aras) o tratadas con FC (barrass oscuras). Las célu ulas fueron co osechadas 16 h después del tra atamiento con FC. El RNA fue exxtraído y sometiido a RT-PCR pa ara evaluar las is soformas de FN N ED DI+ y EDI- como o se describió arrriba. Resuultados 78 Estos resulttados muestrran que la reggulación del splicing sp alternaativo de FN por FC F no requieere síntesis de d nuevas prroteínas ni in nvolucra cam mbios en la estabiilidad relativaa de las difeerentes isoforrmas de mR RNA. Por lo tanto, esta regulaación debe depender del cambio c en la actividad de la maquinariia de splicing pre-exxistente y/o en la eficienccia relativa dee la exportacción del mRN NA desde el núcleo hacia el cito oplasma. 3. Exportaación de los mRNAs m de FN Para evaluaar si los FC pueden alteerar la tasa de d exportació ón de cada NA, medimo os los cocien ntes EDI+/EDI- en fraacciones de isoforrma de mRN RNA A nucleares, citosólicas y totales. Para deterrminar la calidad c del proceedimiento de fraccionamiento, analizaamos en cadaa fracción la abundancia de la proteína SR R SF2/ASF, predominan ntemente nucclear, y de ERK2, E una proteína predom minantementee citoplasm mática (Fig. 18). Los cocientes EDI+ +/EDI- (con n o sin estimuulación) fuero on similares independienttemente del comp partimento analizado a (Fiig. 18). Resuultados simillares fueron n obtenidos cuanddo se analizarron los cocieentes correspo ondientes a minigenes m traansfectados. Estoss datos argum mentan contraa la posibilidad de que loss FC estén faavoreciendo la exp portación de una isoform ma de mRNA A determinad da y por endee apoyan la hipóttesis de una regulación r relacionada dirrectamente co on el proceso o de splicing altern nativo. Figura a 18: Los FC no o alteran la exporttación diferenc cial de las isoform mas de FN. La figura muestrra los cocientes s EDI+/EDI– medido os en las fraccio ones nuclear, citopla asmática y total de células SCp2 lluego de cada tratamiento. t Como control se mues stra un westerrn blot de SF2/A ASF (proteíína predominantemente nuclea ar) y de ERK2 (p proteína predom minantemente citopla asmática) en cad da compa artimento. Resuultados 79 II. Vía de transducción de señales 1. Fosforilación de los componentes de las cascadas de señalización Algunos estudios han asociado la estimulación extracelular con la regulación del splicing alternativo. Sin embargo, las cascadas de señalización que llevan a estos efectos han sido poco exploradas (Stamm, 2002; Lynch, 2004; Shin y Manley, 2004). Las vías que conectan los estímulos extracelulares con sus efectos celulares están agrupadas clásicamente en cascadas de quinasas activadas por agentes mitogénicos (vías de MAPK) o de estrés (vías de SAPK) (Davis, 1993). Nuestros experimentos preliminares utilizando ensayos reporteros de las distintas vías de señalización, basados en la actividad de LUC, mostraron una fuerte activación de la vía Ras-Raf-MEK-ERK1/2 y sólo una débil activación de las vías de p38 y JNK en nuestro sistema de estudio en respuesta a FC. Para confirmar y disectar estos resultados, realizamos ensayos de western blot para detectar las isoformas fosforiladas de ERK y JNK (pERK y pJNK). Observamos un incremento robusto en la señal de pERK y un aumento claro en pJNK luego de 30 min de tratamiento (Fig. 19). Estas fosforilaciones fueron sostenidas en el tiempo, con altos niveles de pJNK y pERK aún visibles luego de 2 y 5 h, respectivamente (datos no mostrados). En contraste, detectamos poca o ninguna fosforilación de p38 luego de 30 min de tratamiento con FC (datos no mostrados). Dado que PI(3)K también es una vía típicamente activada por FC (Potempa y Ridley, 1998), medimos los niveles de fosforilación de AKT/PKB (pAKT), una quinasa que se encuentra río abajo de PI(3)K. Los FC activaron esta cascada, como se concluye al observar los niveles incrementados de pAKT (Fig. 19). En conclusión, encontramos que los FC activan las vías clásicas que llevan a la fosforilación de ERK y AKT, concomitantemente con la activación de la vía de estrés que involucra la fosforilación de JNK. 2. Bloqueo de las cascadas de señalización Para determinar si alguna de estas vías en particular puede ser responsable de los efectos ejercidos por los FC en el splicing alternativo de la Resultados 80 FN, estudiamoss primeram mente la in nfluencia de d varios inhibidores farmaacológicos dee quinasas en la regulación n del splicing allternativo de EDI. Figura 19: HG GF/SF y el MCm mes activan una a variedad de vías de transducción de señales. Las células c fueron lissadas 30 min después de la estimulación po or MCmes y HGF/SF y la fo osforilación de E ERK1/2 (pERK), JNK (pJNK) y AKT/PKB A (pAKT T) fue examinada porr western blot co on anticuerpos específicos. La as membranas ffueron luego reexaminadas con anticuerpos contra ERK2, JNK1 y AKT/PKB (AKT). El bloqueo de la actividdad de MEK K con PD cauusó una dism minución del 25% en el cocien nte EDI+/E EDI- en céluulas sin tratarr. Sin embarrgo, los FC aumeentaron este cociente en proporcioness similares a aquellas obsservadas en ausen ncia del inhib bidor (Fig. 20a,b). Resultaddos similares se obtuviero on con otro inhibiidor de ME EK, U0126 (resultados no mostrado os). Para co onfirmar la funcio onalidad del inhibidor PD, P las célullas fueron co-transfectad c das con un vecto or que codifiica para la enzima e LUC y que llevaa un promottor mínimo conteeniendo secuuencias de unión u de GA AL4 (pG5-L Luc) y otro vector que expreesa una proteeína de fusión n GAL4-ELK K1, capaz dee activar la trranscripción cuanddo ELK-1 se encuentra fosforilado o. La fosfo orilación del factor de transccripción ELK K-1 está aso ociada a la activación a dee la vía Ras--Raf-MEKERK K1/2. En esto os ensayos se observa quee PD es funciional dado quue es capaz de inh hibir la activación por FC C del reporteero GAL-ELK K1 (Fig. 20cc). Por ende conclluimos que laa actividad dee MEK no es necesaria, en e este conteexto celular, para los l efectos dee los FC en la l regulación del splicing dee EDI. Por otro o lado, el bloquueo de la actiividad de PI((3)K con el in nhibidor LY anuló por co ompleto los efecto os inducidoss por HGF//SF (Fig. 200a) y parcialmente los efectos del MCm mes (Fig. 20b)) en la regulacción del spliciing de EDI. En E este último caso, esta inhibiición fue pottenciada por PD (Fig. 200b), sugiriend do un papel menor m pero signifficativo para MEK M en un contexto defficiente en acctividad de PII(3)K. Esto podríía estar asociado a la liberración, en prresencia de LY, L del contrrol negativo que ejerce e AKT/P PKB sobre Raf R (ver Fig. 8). 8 Como era de esperar, LY L bloqueó la fossforilación de d AKT/PKB B inducida por p FC (Figg. 20d) mien ntras que la Resuultados 81 activaación del reeportero GA AL-ELK1 peermaneció in nvariable (Figg. 20c). El bloquueo de la actiividad de p388 o de JNK con los inhib bidores SB 2002190 o SP 6001225, respectivvamente, no o inhibió laa regulación n estudiada (datos no mostrrados). En co oncordancia con la correllación enconttrada entre laa regulación del spplicing de EDII y la de IIIC CS, hallamos que LY es caapaz de inhib bir hasta un 50% de la regulaación ejercidda por HGF F/SF, mientraas que ni PD P –pese a dismiinuir los coccientes basalees de inclusiión de la iso oforma que contiene el motivvo LDV- ni los inhibidorees de JNK o de p38 son capaces c de blloquear este efecto o (Fig. 20e y datos d no mostrados). Figura a 20: La estimu ulación de la in nclusión de los s exones EDI y IIICS-120 es regulada por PI(3)K. (A) Inhibiición de los efe ectos de HGF/S SF sobre el spliicing alternativo o de EDI. Las células c SCp2 fu ueron pre-tratad das con el inhib bidor de MEK1, PD (50 μM); con c el inhibidor de PI(3)K, LY (25 μM) o con vehículo, DMS SO (-) por 3 h y luego tratadas s con el es. (C) Para evaluar la estímulo indicado en presencia de los inhibidores por 24 h. (B) Idem A pero uttilizando MCme funcion nalidad de PD y la especificida ad de LY, la acctivación de la vía v de ERK-MA APK en células SCp2 estimulad das con MCmes fue examinada con el ensayo o basado en la actividad de LU UC de GAL-ELK K1 luego de 4 h de tratamiento (PD 5 y 20 μM respectivamente; LY 25 μM). (D) Western blo ot utilizando anticuerpos contrra pAKT (y AKT T total como control de carga) para revelar extractos e de céllulas estímulada as con MCmes s o sin tratar, en e presencia o ausencia de LY, para CS de FN. evaluar su funcionalidad. (E) Idem A para el análisis de la región IIIC Resuultados 82 Estos resultados arguyen en favor de una participación dominante de la vía de supervivencia de PI(3)K en convertir estímulos extracelulares en cambios en los patrones de splicing de FN. 3. Sobre-expresión de moléculas de las cascadas de señalización El haber encontrado en el transcurso de mi tesis de licenciatura que los transcriptos primarios derivados de un minigen reportero de splicing alternativo del exón EDI de FN son regulables por FC de modo análogo a sus correlatos endógenos, nos permitió realizar estudios de co-transfección de estos minigenes con plásmidos capaces de permitir la sobre-expresión de distintos componentes de las vías de señalización de interés. Dado que la probabilidad de que ambos plásmidos ingresen a las mismas células es muy alta, esta estrategia permite compensar la limitación que ocasiona una baja eficiencia de transfección en el análisis de los mRNAs endógenos. Así, la medición de los patrones de splicing de estos mRNAs derivados de los minigenes resulta un buen indicador de lo que está ocurriendo en las células donde se sobre-expresaron componentes de las cascadas de señalización de interés. Ras es una proteína pequeña con capacidad de GTPasa estimulada por FC y constitutivamente activa en condiciones patológicas como en tumores humanos (Bos, 1989). Cuando se activa, Ras a su vez estimula las vías de RafMEK-ERK1/2 y de PI(3)K (Potempa y Ridley, 1998). Considerando que altos niveles de inclusión de EDI están asociados con la proliferación y con condiciones patológicas y sumando nuestros resultados mostrando que los FC producen la forsforilación de ERK1/2 y de AKT/PKB y que estas vías están involucradas en la regulación del splicing de EDI en nuestro sistema de estudio, razonamos que una forma activa de Ras, Ras(V12), debería estimular la inclusión de EDI en el mRNA maduro. De manera consistente, la sobreexpresión de Ras(V12) no sólo activó el reportero co-transfectado GAL-ELK1 sino que incrementó el cociente EDI+/EDI- de transcriptos derivados de los minigenes reporteros de splicing (Fig. 21a). El agregado de LY o de LY en combinación con PD bloquearon, como se esperaba, parte de estos efectos (Fig. 21b). Estos experimentos demuestran que la actividad de Ras es capaz de estimular la inclusión de EDI en el mRNA y confirman la preponderancia de la vía de PI(3)K en esta estimulación. Luego extendimos estos resultados mostrando que un doble mutante de Ras, Ras(V12-C40), constitutivamente activo pero que a diferencia de Ras(V12) Resultados 83 estim mula predomin nantemente la vía de PI((3)K (Oliva et al., 2004) es también capazz de incremeentar el cocieente EDI+/EDI- en traanscriptos deerivados del miniggen reportero o de splicing (F Fig. 22a, paneel superior). La L selectividaad del doble mutan nte de Ras, respecto r de las l vías que activa a río abaajo, fue conffirmada por ensayyos de westernn blot para pERK p y pAK KT, mostran ndo un aumeento de los nivelees de pAKT pero p no de lo os de pERK (Fig. ( 22a, pan nel inferior). Estos resultados pruebaan que la vía de PI(3)K no n sólo es neccesaria sino tambiién suficientee para alterar la regulación n del splicing de EDI. F Figura 21: Una forma c constitutivamen nte activa de Ras R in nduce la inclus sión del exón EDI. E (A A) La co-transfe ección de una c construcción que e codifica para R Ras(V12) estimu ula la inclusión de d E de manera d EDI dosis-dependien nte (0 0, 0,5 y1 μg) en n transcriptos g generados a parrtir de un minige en de E EDI. El RNA fue extraído 48 h posp trransfección. Lass barras represe entan e cociente EDI+ el +/EDI- y la línea re epresenta las unidades de LUC C re elativas (RLUs) provenientes del d re eportero GAL-E ELK1. (B) Inhibic ción de los efectos de e Ras(V12). 24 h p pos-transfección n (1 μg de Ras(V V12) o de vector vacío o), las células fu ueron trratadas con PD (50 μM), LY (25 5 μ o una combinación de amb μM) bos. L Luego de 24 h, sse extrajo el RN NA y se realizó la RT--PCR. Resuultados 84 Figura 22: La a activación de e la vía de PI(3)K y de su blan nco río abajo, AKT/PKB, A es suficiente s para alterar el splic cing alternativo de d EDI. (A) Las células SCp2 y Hep3B fueron co-transfectada as con el minige en de EDI y 1 μg g de pCEFL-KZ Z-AU5Ras(V12C40) o su vector va acío (-). Se muestra el análisis de d RT-PCR de las isoformas EDI+ E y EDI- derivadas del minig gen. La expresión de Ras(V12C40) y la activación de d la vía de PI3(K) fueron corro oboradas por we estern blot (WB) contra AU5, pAKT p y pERK. Un we estern blot contrra ERK2 es mosstrado como co ontrol de carga. (B) Las células SCp2 y Hep3B B fueron co-trans sfectadas con el minige en de EDI y 1 μg g de pCDNA3-R Rac(QL) o vecto or vacío (-). Los cocientes EDI+ +/EDI- fueron ca alculados como en A. La sobre-expressión funcional de e Rac fue confirrmada midiendo o la actividad LU UC en lisados de células co-tra ansfectadas con pG5-Luc, pGBDXGal4--Atf2 y pCDNA3 3-Rac(QL) o bien vector vacío (-). ( (*) indica p<0.05 (Test de Student). S (C) Lass células SCp2 y Hep3B fueron co-transfectadas con el minigen de EDI E y 500 ng de e pCMV6-HA-AK KT Myr o vectorr vacío (-).Los ccocientes EDI+/E EDI- fueron calculados co omo en A. La so obre-expresión de AKT Myr fue e confirmada po or análisis de we estern blot con u un anticuerpo contra HA. Resuultados 85 PI(3)K puede ejercer sus efectos mediante la activación de la proteína pequeña GTPasa Rac, de AKT/PKB o de ambas (Zhao et al., 2003). Para evaluar si Rac o AKT/PKB actúan como blancos río abajo de PI(3)K en este fenómeno regulatorio, sobre-expresamos mutantes constitutivamente activos de ambas proteínas por separado. La sobre-expresión de Rac(QL), capaz de inducir fuertemente la transcripción de LUC a partir de un reportero GAL4-ATF2 inducible por la vía de Rac, no logró inducir ningún efecto en el splicing alternativo de EDI (Fig. 22b). Por el contrario, la sobre-expresión de una forma activa de AKT/PKB (AKT Myr) aumentó los niveles de EDI+/EDI- en transcriptos derivados del minigen de EDI (Fig. 22c). Estos resultados, en conjunto con aquellos que mostraban la fosforilación de AKT/PKB en respuesta a la estimulación con FC (Fig. 19), sugieren fuertemente que PI(3)K está actuando vía AKT/PKB para estimular la inclusión de EDI en el mRNA de FN. III. Papel de las proteínas SR 1. Knock-down de proteínas SR La inclusión del exón alternativo EDI en el mRNA de FN es regulada por la unión de proteínas SR al elemento ESE polipurínico (Lavigueur et al., 1993; Buratti et al., 2004). La sobre-expresión de un número de proteínas SR promueve la inclusión de EDI en transcriptos derivados de un minigen transfectado. Entre ellas, SF2/ASF y 9G8 muestran los efectos estimulatorios más fuertes (Cramer et al., 1999). El trabajo realizado durante mi tesis de licenciatura mostraba que el aumento de la inclusión de EDI en el mRNA de FN en respuesta a FC requiere de un elemento ESE intacto en EDI. Por lo antedicho, analizamos el papel de las proteínas SR en este fenómeno regulatorio utilizando siRNAs diseñados para hibridar con los mRNAs que codifican para proteínas SR humanas específicas. Analizamos el efecto mediado por FC en el splicing alternativo de transcriptos derivados del minigen de EDI en células donde se realizó un knock-down de SF2/ASF o de 9G8 por un mecanismo de RNAi. El análisis por western blot con anticuerpos contra SF2/ASF y 9G8 reveló que cada siRNA específico disminuye los niveles endógenos de la proteína correspondiente en más de un 50% sin afectar el de la otra (Fig. 23a,b). Como Resultados 86 la traansfección deel siRNA no o es 100% eficiente e y esto puede lllevar a una subesstimación dee la efectiviidad del knnock-down en cada célula, también analizzamos por weestern blot la expresión dee T7-SF2/ASSF o de T7-9G8 a partir de suus respectivoss plásmidos, co-transfectaados con los siRNAs. Estta estrategia reveló ó la abundan ncia de estas proteínas p en células que efectivamente e e contenían el min nigen de EDII transfectado en conjuntto con el siRN NA. Estos exxperimentos de co o-transfección n mostraron que q la eficien ncia de knock-down es de casi el 100% (datos no mostraados). Notabllemente, un siRNA conttra SF2/ASF F inhibió la inclussión de EDI en el mRNA A, tanto a niveel basal (Fig. 23a, 2 calles 1 y 3) como a nivel de la estimuulación por FC (comparrar las calles 1 y 2 con las 3 y 4), s contrra 9G8 inhibiió específicam mente la reguulación por mienttras que un siRNA FC sin afectar lo os niveles baasales (comp parar calles 1 y 2 con 5 y 6). En contrraste, un siRN NA contra la proteína p SC335 no tuvo effecto en la reggulación del splicing ng de EDI po or FC (datoss no mostraddos). Estos datos d sugiereen que 9G8 tiene como funciión transduccir la inform mación desdee el medio extracelular, e mienttras que SF22/ASF particcipa no sólo en esta reguulación sino también en manteener los niveeles basales de d inclusión de d EDI. Máss aún, el efeccto de AKT Myr fue f bloqueaddo de maneraa similar por siRNAs conttra 9G8 y po or SF2/ASF (Fig. 23b). 2 Figura 23: SF2/ASF y 9G G8 están impliicados en la regulación r del splicing de EDI mediada po or FC y AKT/P PKB. (A) Las células Hep p3B fueron co-trransfectadas co on el minigen de e EDI y los siRN NAs indicados. 24 2 h después d de la transfecció ón, las células fueron trata adas con FC. Se S muestra el análisis de RT T-PCR, los coc cientes EDI+/ED DI- de un expe erimento repres sentativo y el porcentaje de estimulación n de los mismoss por FC (promedio entre diferrentes experime entos, el 100% corresponde al aumento del cociente ED DI+/EDI- provoccado por FC en n ausencia de un u siRNA específico). El knockk-down de SF2 2/ASF y 9G8 en ndógenas fue confirmado por western bllot. (B) Las célu ulas Hep3B fue eron co-transfec ctadas con el minigen m de EDI, con 500 ng de e pCMV6-HAAKT Myr o vector vacío (-)), y con los siR RNAs indicados. Los cocientes EDI+/EDI- fuerron analizados p por RT-PCR. El knock-down de SF2/ASF F y 9G8 endóge enas, así como la sobre-expressión de HA-AKT T Myr fue confirm mada por weste ern blot. Resuultados 87 2. El ESE de 9G8 como elemento de respuesta a FC Para continuar con la exploración del papel de las proteínas SR como mediadores de la regulación del splicing de EDI en respuesta a FC, creamos un minigen artificial insertando un sitio de pegado para 9G8 en el exón alternativo EDII (pEDB-9G8, Fig. 24a) que, en su versión wild type y como se describiera anteriormente, no es regulado por FC. Nuestra hipótesis fue que si 9G8 está realmente transduciendo información desde el medio extracelular, la inserción de un ESE para 9G8 dentro de EDII debería ser suficiente para volver al splicing de este exón, regulable por FC. Efectivamente, encontramos que el reclutamiento de 9G8 le confiere a EDII la capacidad de ser regulado por FC (Fig. 24b). Como control, evaluamos la sensibilidad de los diferentes minigenes de EDII utilizados a la sobre-expresión de 9G8. Como era previsto, el minigen pEDB-9G8 mostró la mayor respuesta (Fig. 24c). Obtuvimos resultados similares al reemplazar el ESE de EDI, que lleva un motivo que prácticamente coincide con la secuencia consenso para SF2/ASF, 9G8 y Tra2β (Cramer et al., 1999), por un ESE específico para 9G8 (datos no mostrados). Estos resultados apoyan fuertemente la participación de proteínas SR, y en particular de 9G8, en la vía regulatoria estudiada. 3. Fosforilación de las proteínas SR Las proteínas SR son extensamente fosforiladas en su dominio RS y su estado de fosforilación puede influir en su especificidad de unión al RNA, en su actividad en el proceso de splicing y en su localización subcelular (Graveley, 2000). Nuestros resultados previos muestran que los efectos de los FC pueden observarse a las pocas horas de estimulación y que son independientes de la síntesis de nuevas proteínas (Fig. 17 y datos no mostrados). Esto es consistente con un posible cambio en los niveles de fosforilación de las proteínas SR. En efecto, el análisis por western blot de geles bidimensionales mostró que la distribución de isoformas proteicas de SF2/ASF, que se observa como una mancha dispersa en zonas de alto punto isoeléctrico en células control, se vuelve una mancha compacta con un punto isoeléctrico más bajo en respuesta a FC, mientras que la distribución del patrón de isoformas de ERK2, utilizado como control dado que su fosforilación sólo es regulada a tiempos cortos por FC (datos no mostrados), no cambia (Fig. 25a). Debido a la presencia de varias serinas, las proteínas SR son proteínas básicas y por ende poseen un alto punto Resultados 88 isoelééctrico. Com mo la fosforrilación puedde reducir drásticamente d e el punto isoelééctrico de las proteínas SR R, estos resulttados sugieren n fuertementte que la vía de traansducción de d señales gaatillada por laa unión de lo os FC a su receptor r de memb brana conllevva un cambio o en el patrón n de fosforilacción de SF2/ASF. α-globina FN α-globina a Figura 24: El splicing alternativo a de los transcripto os proveniente es de una cons strucción de ED DII conteniendo un ESE para 9G8 8 es regulable por FC. (A) Essquema de los minigenes de FN F EDII creadoss. Un ESE para a 9G8 fue inserrtado en la orientació ón correcta (pE EDB-9G8) o antisentido (pEDB B-9G8as) dentro o del exón de EDII E (rectángulo o central oscuro o). (B) Las células SCp2 S fueron tra ansfectadas con n diferentes minigenes de ED DII y tratadas co on FC. Los coccientes EDII+/EDII-, tanto correspondientes a los mRNA derivad dos de los minigenes como de el gen endógen no, fueron anallizados por RT-PCR. (C) Compara ación de la sensibilidad (evaluada como cambio en el cociente EDII+/EDII--) de los distinto os minigenes a la sobreexpresión n de 9G8 en células SCp2. La sobre-expresión de T7-9G8 fue confirmada po or western blot contra T7. 4. Quinasaas de proteín nas SR Dado que las familias de proteínaas quinasas SRPK y Clkk han sido caractterizadas com mo modificaadoras de lo os niveles de d fosforilacción de las proteínas SR, espeeculamos quee el tratamien nto con FC podría p estar aumentando a e la sobre-expressión de Clk1,, Clk2 y Clk33 inhibió la su actividad. Sin embargo, inclussión de EDI en el mRNA A de FN (Figg. 25b), en co ontraste con los efectos gatillaados por los FC o por la sobre-expressión de AKT T Myr. De mo odo similar, aumeentar los niveeles de SRPK K1 o SRPK2 disminuyó el e cociente EDI+/EDIE (Fig. 25c). 2 Se ha reporrtado que la sobreexpresiión de Clk o de SRPK es e suficiente para cambiar c la loccalización de las proteínass SR desde lo os speckles nuccleares hacia una lo ocalización diifusa (compaarar Fig. 26a,b b). Resuultados 89 Fiigura 25: La sobre-expresió s n de quinasas s de proteínas s SR provoca efectos en el splicing que son s op puestos a los producidos p po or los FC y porr la sobre-expre esión de AKT Myr. (A) Las cé élulas SCp2 fue eron tra atadas con FC o permaneciero on sin estimularr. 100 μg de pro oteína total fuerron sembrados en el cátodo (C C) y se eparados por migración haciia el ánodo (A A). Luego del isoelectroenfoq que (IEF), las proteínas fue eron se eparadas en un n SDS-PAGE en n la segunda diimensión. SF2/A ASF y ERK2 en ndógenos fuero on visualizados por w western blot. (B) Las células SC Cp2 fueron co-ttransfectadas con el minigen de d EDI y con 1 μg de pECE-M MycClk1, 2 o 3. Loss cocientes ED DI+/EDI- fueron analizados porr RT-PCR. (C) Idem B, pero sobre-expresan ndo SRPK1 o 2. La sobre-expresió ón de Clk y de SRPK fue confirmada c por western blot ccontra Myc o HA, H espectivamente.. re La alteració ón de la locallización nucllear de las prroteínas SR e incluso su remoción del núclleo en respueesta a la sobrre-expresión de estas dos familias de quinaasas (Colwill et e al., 1996; Cáceres C et al., 1998; Kuroyyanagi et al., 1998) podría ser laa causa de la inhibición de la inclussión de EDII en el mRN NA de FN obserrvada en esass mismas con ndiciones. Po or el contrariio, ni la sobre-expresión de AKT A Myr (F Fig. 26c) ni el tratamien nto con FC (datos no mostrados) desorrganizaron lo os speckles nuccleares ni inddujeron una lo ocalización citoplásmica c de SF F2/ASF, lo cuual correlacio ona con un auumento del co ociente EDI+ +/EDI-. Resuultados 90 Estos resultados sugieren que los cambios en el splicing alternativo que disparan los FC y AKT/PKB no son debidos a incrementos en la actividad de Clk, SRPK o ambas. 5. AKT/PKB es una quinasa de proteínas SR Los dominios RS de SF2/ASF y de 9G8 contienen varios motivos putativos para la fosforilación por AKT/PKB (RXRXXS/T, Fig. 27a). Por lo tanto, es concebible que la misma AKT/PKB sea responsable de fosforilar a las proteínas SR. Para evaluar esta hipótesis, analizamos si AKT/PKB es capaz de forsforilar a las proteínas SR, en particular a aquellas que están involucradas en la regulación del splicing alternativo descripta en este trabajo. Mediante ensayos de quinasa in vitro, encontramos que AKT/PKB es capaz de fosforilar a SF2/ASF y a 9G8, y que esta fosforilación es sustancialmente reducida por la sustracción del dominio RS de dichas proteínas (Fig. 27b). En contraste, una mutante inactiva de AKT/PKB, AKT KM, es incapaz de fosforilar a SF2/ASF (Fig. 27b), confirmando que la actividad de AKT/PKB es requerida para la fosforilación de las proteínas SR in vitro. Estos resultados demuestran por un lado que AKT/PKB puede, de hecho, funcionar como una quinasa de proteínas SR y por el otro que su sobre-expresión ejerce, al menos sobre el splicing alternativo de FN, efectos opuestos a los de las familias de quinasas previamente descriptas SRPK y Clk. IV. Regulación de la traducción 1. Regulación de la traducción por FC en forma dependiente de proteínas SR Trabajos recientes demostraron que las proteínas SR no sólo funcionan como reguladores del splicing, sino que también toman parte en otros aspectos del metabolismo del mRNA, como su exportación, estabilidad y traducción como se discute en un review reciente (Huang y Steitz, 2005). Resultados 91 Figu ura 26: AKT/PK KB, a diferenc cia de Clk2, no n desorganiza a los speckles s. (A-C) Las células SCp2 fu ueron transsfectadas con vector v vacío (A A), pECE-Myc-C Clk2 (B) o pCM MV6-HA-AKT Myr M (C). En cad da caso, las cé élulas fuero on co-transfecta adas con pEGF FP-SF2/ASF. La a inmunofluorescencia contra Myc o HA revveló la expresió ón de Clk2 o AKT Myr resspectivamente. EGFP-SF2/ASF F se muestra en n verde, el iodu uro de propidio ((IP), para revela ar los núcle eos celulares, en e rojo y HA-AK KT Myr o Myc-Cllk 2, en azul. Ba arra: 5 μm. n encontram mos influencia de los FC ni en la exp portación ni Dado que no en la estabilidad diferenciales de las isoforrmas de mRN d NA de FN (F Figs. 17-18) deciddimos exploraar una posiblle influencia de d la vía FC--Ras-PI(3)K-A AKT/PKB sobree la traducción, centrando nuestra aten nción en el paapel de las prroteínas SR. Para ello, utilizam mos reporteros traduccionales que contienen laa secuencia Resuultados 92 codifi ficante para LUC L y el ESE E de EDII (pLCS-EDA A) o bien una u versión mutan nte del mism mo (pLCS-ED DAmt) que no n es capaz de unir SF22/ASF (Fig. 28a). Previamentee, fue descrip pto que la sob bre-expresión n de SF2/ASSF aumenta la acttividad LUC derivada del reportero pL LCS-EDA (Saanford et al., 2004). Más aún, nosotros n encontramos quue los FC estimulan preferrencialmente la actividad LUC del reportero o pLCS-EDA A por sobre la del pLCS--EDAmt (Fig.. 28b). Esta estim mulación no puede p ser exxplicada por diferencias en e los niveless de estado estaciionario de sus corresponddientes mRNA As, como se observa en el e análisis de RT-P PCR cuantitattiva (Fig. 28cc). El papel de d las proteín nas SR en la traducción fue co onfirmado po or la observaación de que los siRNAs contra SF2/A ASF y 9G8 bloquuearon la estiimulación de la traducción desencaden nada por FC C (Fig. 28d). Finalm mente, analizzamos si AK KT/PKB puuede modificar la traduccción de un modo o dependientee de la presen ncia de un ESE. En efectto, la sobre-exxpresión de AKT Myr aumen ntó predominantemente la traducción del reporttero pLCSEDA A en comparaación con aqquella determ minada a parttir del reportero pLCSEDA Amt (Fig. 28e). Figura a 27: AKT/PKB puede funcion nar como una quinasa q de pro oteínas SR. (A) Secuencia amiinoacídica de SF2/ASF y 9G8 hu umanas, destaccando los sitioss potenciales de d fosforilación por AKT/PKB (en negro). (B B) Iguales cantid dades de histona a H2B (control positivo) o de e proteínas de fusión recomb binantes GST-S SR fueron utilizzadas como su ustrato en ensayo os de quinasa de d AKT/PKB. Se e evaluó la actividad quinasa de d AKT/PKB wiild type (AKT w wt) o del mutante e inactivo AKT KM M previamente inmunoprecipita ados. Como con ntrol (-), el inmu unoprecipitado de d células sin trransfectar fue in ncluido en 32 lugar de d la quinasa. Las L autoradiogrrafías muestran n la señal radia activa de H2B ( P-H2B) y de e las proteínas de fusión 32 GST-SR ( P-proteína a SR). La tinción n con Coomasssie Blue muestra a que fueron se embradas cantidades similares s de cada proteín na de fusión. La sobre-expresió ón de AKT (wt o KM) fue confirm mada por weste ern blot contra H HA. Resuultados 93 Figura 28: Los FC y AKT A Myr altera an la traducción n de mRNA que contienen un n ESE. (A) Reporteros de LUC utilizados para los enssayos de traduccción in vivo. (B)) Las células SC Cp2 fueron transsfectadas con p pLCS-EDA o pLCSmt EDA y tratadas con FC. F 48 h despué és, fue evaluada la actividad LUC en los lisado os celulares. (C C) Se muestra la a amplificcación de los mRNA derivadoss de los reporterros de LUC por RT-PCR en tiem mpo real. (D) La as células Hep3 3B fueron co-transfectada as con pLCS-ED DA y los siRNAss indicados y tra atadas con FC. Posteriormente e, fue evaluada la activida ad LUC en los liisados (100% corresponde a la a estimulación de d la actividad LUC L por FC en a ausencia de un siRNA específico). El knock-down k de SF2/ASF y 9G8 8 endógenas fue confirmado po or western blot. (E) Las células s mt SCp2 fueron f co-transffectadas con 50 00 ng de pCMV6 6-HA-AKT Myr o vector vacío (--) y con pLCS-E EDA o pLCS-ED DA . Luego de 48 h, se mid dió la actividad LUC. L La sobre-e expresión de AK KT Myr fue conffirmada por wesstern blot contra a HA. Resuultados 94 Estos resultados muestran, en conjunto, que la cascada de señalización disparada por FC no sólo regula el splicing del pre-mRNA sino que también afecta el modo en que el mRNA maduro es traducido, indicando que ambos procesos son regulados por un mecanismo dependiente de las mismas proteínas SR. 2. SF2/ASF regula la traducción alternativa de reporteros bicistrónicos Hasta el momento, poco se sabe acerca de cómo es que las proteínas SR estimulan la traducción, si lo hacen fomentando la iniciación de la traducción, la elongación y/o el reclutamiento a sitios de activa traducción. La traducción de la mayoría de los mRNAs eucarióticos es iniciada por el mecanismo de escaneado, que implica el reconocimiento del extremo 5´ del mRNA y su estructura m7G-cap por el complejo que contiene al factor de iniciación de la traducción eucariota 4F (eIF4F) que es un complejo multiproteico. Por otro lado, el inicio de la traducción puede ser mediado por elementos que actúan en cis llamados IRESs que estimulan la unión del ribosoma a un codón de iniciación sin requerir el reconocimiento del m7G-cap por parte de eIF4F (Hellen y Sarnow, 2001). Varios RNAs virales, los primeros ejemplos en los cuales se describió la actividad de IRESs, son traducidos cuando la iniciación de la traducción dependiente de cap es inihibida por proteínas virales en la célula infectada (Pelletier y Sonenberg, 1988). Con el tiempo, se han descubierto que muchos mRNAs celulares eucariotas pueden también ser traducidos vía un mecanismo de traducción independiente de cap pero mediado por IRESs (Hellen y Sarnow, 2001). A pesar de que la traducción mediada por IRESs ha sido considerada usualmente como un mecanismo de traducción alternativa en contraste con el mecanismo (canónico) dependiente de cap, haremos alusión aquí a “traducción alternativa” como la producción de diferentes proteínas a partir de un mismo mRNA, a través del balance entre estos dos mecanismos de iniciación de la traducción. Nos propusimos entonces analizar la actividad de SF2/ASF en la traducción dependiente de cap y en la dependiente de IRES, hipotetizando que esta proteína podría no sólo funcionar como reguladora del splicing alternativo sino también de la traducción alternativa, expandiéndose más aún su ya descripto potencial para incrementar la diversidad proteica. Resultados 95 Con este objetivo, utilizamos reporteros bicistrónicos que contienen dos marcos de lectura abiertos u open reading frames (ORFs), el de CAT en el extremo 5´ y el de LUC en el extremo 3´. La traducción del primer ORF es dependiente de cap, mientras que la del segundo es independiente de cap pero depende de la presencia de un IRES del gen que codifca para cat1. Este IRES celular ha sido colocado entre ambos ORFs y se activa por hambreado de aminoácidos (Yaman et al., 2003). En esta construcción, CAT y LUC son traducidos a partir de un único mRNA, eliminando diferencias debidas a la eficiencia de transfección así como a efectos en los niveles de RNA. Ambos cistrones, así como la secuencia IRES contienen varias secuencias potenciales de unión para SF2/ASF (Fig. 29a) según lo predicho por el ESEfinder©, un programa diseñado para detectar putativos sitios de unión para las distintas proteínas SR (Cartegni et al., 2003; Smith et al., 2006). Primeramente, validamos que este reportero alternativo pudiera efectivamente reportar la regulación de la traducción alternativa (es decir el cociente CAT/LUC como indicador de la traducción dependiente de cap en función de la dependiente de un IRES) exponiendo a las células Hep3B a una hambreado de aminoácidos o, en contraste, sobre-expresando AKT-Myr. El estrés de aminoácidos disminuyó el cociente CAT/LUC (Fig. 29b), lo cual es consistente con el hecho de que fue reportado que este tratamiento aumenta la actividad del IRES de cat1 e inhibe la traducción dependiente de cap en células de glioma de rata y en fibroblastos embrionarios (Fernandez et al., 2001; Yaman et al., 2003). Por el contrario, la sobre-expresión de AKT Myr aumentó el cociente CAT/LUC (Fig. 29c), lo cual es predecible dado que AKT/PKB estimula la traducción a nivel del reclutamiento de RNAs a polisomas en forma dependiente de cap, modificando la actividad de factores de iniciación de la traducción (Gingras et al., 1998). Luego, sobre-expresamos SF2/ASF y encontramos un aumento consistente del cociente CAT/LUC (Fig. 29d). Más aún, el knock-down de SF2/ASF endógeno por una estrategia de RNAi provocó el efecto opuesto (Fig. 29e). Por lo tanto, SF2/ASF, al igual que AKT/PKB, puede funcionar como un regulador de la traducción alternativa. La sobre-expresión de SC35, una proteína SR incapaz de traslocar entre núcleo y citoplasma en forma dinámica, tiene consecuencias sobre el splicing alternativo del mRNA de FN y sobre el del adenovirus E1A que son similares a las provocadas por la sobre-expresión de SF2/ASF (Cáceres et al., 1994; Wang y Manley, 1995; Cramer et al., 1999). Sin embargo, SC35 no es capaz de alterar el cociente CAT/LUC (Fig. 30a), lo cual es consistente con su incapacidad para abandonar el núcleo celular. Resultados 96 Figura 29: SF2 2/ASF regula la a traducción altternativa de un n reportero bicistrónico in viv vo. (A) Esquem ma del reportero bicistrón nico CAT/LUC utilizado u para lo os ensayos de trraducción altern nativa in vivo. Lo os potenciales sitios s de e unión para SF2/ASF son mosstrados para cad da región del reportero de acue erdo a su posiciión y score en el e ES SEfinder. El sco ore se obtiene asignando un pu untaje a cada nu ucleótido de una a secuencia corrta, dependiendo o de la po osición en que aparece a el mism mo. Dicho score se basa en exp perimentos de SELEX. S (B) Las células Hep3B fueron tra ansfectadas con n el reportero bicistrónico pSVC CAT/cat1-IRES//LUC y 5 h desp pués fueron privvadas de Resuultados 97 Figura 29 (continuación): aminoácidos (estrés AA) o dejadas sin tratar (-). Luego de 48 h, las actividades CAT y LUC fueron evaluadas para calcular los cocientes CAT/LUC. (C) Las células Hep3B fueron co-transfectadas con el reportero bicistrónico y 500 ng de pCMV6-HA-AKT Myr o vector vacío (-). Luego de 48 h, las actividades CAT y LUC fueron evaluadas para calcular los cocientes CAT/LUC. La sobre-expresión de AKT Myr fue confirmada por western blot contra HA. (D) Idem C, pero para la co-transfección del reportero bicistrónico y 200 ng de pCGT7SF2/ASF o vector vacío (-) (E) Las células Hep3B fueron co-transfectadas con el reportero bicistrónico y 40 pmol de cada siRNA. Luego de 48 h, las actividades CAT y LUC fueron evaluadas para calcular los cocientes CAT/LUC. El knock-down de SF2/ASF fue confirmado por western blot. (*) indica p<0.05 (Test de Student). El efecto de SF2/ASF en la traducción alternativa no está restringido a un IRES particular. Cuando se co-transfecta SF2/ASF con una construcción bicistrónica en la que el IRES de cat1 ha sido reemplazado por el IRES celular del gen que codifica para BiP, se encuentra de nuevo un aumento consistente del cociente CAT/LUC (Fig. 30b). Más aún, un siRNA contra SF2/ASF disminuye este cociente como en el caso anterior (Fig. 30c). De modo análogo, cuando se utiliza un reportero bicistrónico conteniendo entre ambos ORFs el IRES del HCV se obtienen resultados similares (Fig. 30d, e). Los efectos de SF2/ASF en la traducción alternativa, por lo tanto, no pueden ser extrapolados a todas las proteínas SR y muy probablemente, dependen de su capacidad de transportarse del núcleo al citosol. Por el contrario, el efecto de la sobre-expresión de SF2/ASF sobre la regulación de la traducción alternativa sí se puede extender, al menos, a otros casos diferentes como lo son los reportados en el análisis con el IRES celular de BiP y el IRES viral de HCV. 3. Correlación entre la capacidad de SF2/ASF de regular el splicing alternativo y la de alterar la traducción alternativa Con el objeto de evaluar si existe una correlación entre la capacidad de SF2/ASF para regular el splicing alternativo con su habilidad para controlar la traducción alternativa, analizamos el efecto en ambos procesos no sólo de sobre-expresar o inhibir la expresión de SF2/ASF sino también las consecuencias de sobre-expresar dicha proteína pero habiendo eliminado cada uno de sus dominios modulares. En cada caso, evaluamos el efecto en el splicing alternativo, como el cociente EDI+/EDI- obtenido por análisis de RT-PCR de transcriptos derivados del minigen reportero de splicing de EDI y el efecto en la Resultados 98 traducción alternativa como cociente CA AT/LUC ob btenido a partir p de la transffección de los reporteros bicistrónicos b . Figura 30: Los efectos e de SF2 2/ASF pueden ser s generalizad dos para otro IR RES pero no p pueden ser re eproducidos po or SC35. (A) La as células Hep3 3B fueron co-transfectadas con el reportero biccistrónico y 20 00 ng de pCGT T7-SF2/ASF, pC CGT7-SC35 o ve ector vacío (-). Luego L de 48 h, las actividades CAT y LUC fu ueron evaluadass para calcular los l cocientes CA AT/LUC. La sob bre-expresión de SF2/ASF y de e SC35 fue co onfirmada por western w blot con ntra T7. (B, C) Id dem Fig. 29d, e, pero utilizando o el vector pSVC CAT/BiP IR RES/LUC. (D, E) E Idem Fig. 29d d, e, pero utilizan ndo el vector pH HPI1484 que co ontiene el IRES de HCV. (*) in ndica p<0.05 (Te est de Student).. Resuultados 99 Encontram mos una imp portante corrrelación (ρ= = 0,927) en ntre ambos proceesos (Fig. 31aa), sugiriendo o que la abunddancia y/o acctividad de essta proteína puedeen proveer una u fuerte coordinación c de ambos procesos quue dan por resulttado una exp pansión de la diversidad proteómica. p En E este conteexto celular, cada uno de los dominios modulares m dee SF2/ASF resulta r cruciaal para sus funcio ones en spliciing y traducción alternativas, implicand do que estos efectos son depen ndientes de laas funciones ejercidas e por estos domin nios. Figura 31: Análisis de correlación. (A) Aná álisis de correlac ción de la regula ación de la traducción alternativa (eva aluada como co ociente CAT/LUC) versus la del splicing alterna ativo (evaluada como cociente EDI+//EDI-). Las células fueron co-trransfectadas con el reportero bicistrónico b o con el minigen de EDI, y con pCGT7-SF2/AS p SF (wt), sus muttantes por delec ción (ΔRS, ΔRR RM1 o ΔRRM2), siRNA contra SF2/AS SF o vector vacío (-). 48 o 72 h más tarde, las células fueron colectadas para a el análisis de las actividades CAT y LUC C o para el aislamiento del RNA A y posterior RT T-PCR. (B) Para a confirmar que T7-SF2/AS SF y sus mutan ntes son sobre-e expresados en modo m similar, lo os niveles de expresión fueron evaluad dos por western n blot contra T7. Resuultados 100 4. SF2/ASF regula la traducción alternativa de genes endógenos Finalmente, intentamos reproducir estos resultados analizando la traducción de un mensajero endógeno. Con ese objetivo, trabajamos con el mRNA de FGF-2 humano. Dicho mRNA posee cinco codones de iniciación de la traducción en marco (4CUGs y 1 AUG) que dan origen a cinco isoformas proteicas de FGF-2 que varían en sus extensiones amino-terminales. Mientras que la traducción de la isoforma de 34-kDa es iniciada por un mecanismo dependiente de cap, las isoformas más pequeñas son iniciadas por un proceso mediado por un IRES (Fig. 32a). Estas isoformas diferentes de FGF-2 tienen distinta localización y función, y la expresión de cada una de ellas es regulada traduccionalmente dependiendo del tipo celular o el estado fisiológico de la célula (Bonnal et al., 2005). Analizamos los patrones de expresión de FGF-2 por western blot con un anticuerpo que reconoce todas las isoformas proteicas de FGF-2. Encontramos que, de modo similar a lo observado para los reporteros bicistrónicos, un siRNA contra SF2/ASF es capaz de alterar el patrón de traducción alternativa, en particular, disminuyendo la proporción de la isoforma que se traduce por un mecanismo dependiente de cap y aumentando la proporción de aquellas que dependen de un IRES para poder ser traducidas (Fig. 32b). Dependiendo del experimento, los niveles de la isoforma de 34-kDa disminuyeron o permanecieron sin cambio. Sin embargo, el cociente de traducción dependiente de cap en función del dependiente de IRES fue afectado siempre del mismo modo. Estos resultados validan los obtenidos previamente con reporteros bicistrónicos, con la ventaja de que aquí no se están midiendo dos actividades enzimáticas diferentes. Además, agregan un cuarto ejemplo (sumado a los anteriores en que se utilizaron los IRESs de cat1, BiP y HCV) en donde la traducción alternativa puede ser regulada por SF2/ASF. Más importante, muestran que SF2/ASF puede afectar la traducción alternativa de mRNAs endógenos. La regulación de la abundancia y/o actividad de SF2/ASF puede ser, por lo tanto, no sólo un mecanismo para cambiar los patrones de splicing alternativo sino también una vía por la cual las células pueden cambiar los patrones de traducción alternativa de los mRNAs que contienen IRESs. Resultados 101 Fig gura 32: El kno ock-down de SF F2/ASF cambia a la traducción n alternativa de el mRNA endóg geno de FGF-2. (A) Esquema del mRN NA de FGF-2 hu umano y de las proteínas deriv vadas de su trad ducción alternattiva. (B) Células s He eLa (las Hep3B producen muy bajas b cantidade es de FGF-2) fueron transfectad das con diferentes siRNAs y collectadas 72 h después. Se mue estra el análisiss de western blo ot con anticuerpos contra FGF-2, SF2/ASF y ER RK2. Resuultados 102 DISCUS D SIÓN Actualm mente sabeemos que las proteeínas SR, priimeramente descriptas d co omo factores regulatorios del splicing, tam mbién particcipan en exxportación, estabilidad, e control de callidad y traduccción del mR RNA. Los daatos presentados en esta tessis refuerzan n la concepción de quue estas pro oteínas son regguladores exccepcionales y multifacético os. Al 2007, existe un creciente número de trabajos explorando la influencia de las señales extracelulares en la regulación del splicing alternativo a través de la activación de diversas vías de transducción de señales (Stamm, 2002; Lynch, 2004; Shin y Manley, 2004; Blaustein et al., 2007). Sin embargo, en la mayoría de los casos, la cascada de señalización completa conectando el estímulo extracelular con la maquinaria nuclear de splicing no ha sido definida. En este trabajo se muestra que diferentes FC, tales como HGF/SF, así como el MCmes son capaces de regular el splicing de dos de las tres regiones alternativas del transcripto primario de FN. Específicamente, son capaces de provocar un aumento en la inclusión de EDI y IIICS pero no de EDII, en diferentes líneas celulares. El reporte de esta co-regulación del splicing alternativo de IIICS y EDI es novedoso y sugiere que estas dos regiones podrían estar reguladas por secuencias similares en cis, por los mismos factores en trans o, eventualmente, por diferentes factores que responden a las mismas vías de señalización. La FN es ligando para al menos una docena de miembros de la familia de receptores conocidos como integrinas. EDI es capaz de unirse a las integrinas α9β1 y α4β1 (Liao et al., 2002) y IIICS contiene sitios de unión para las integrinas α4β1 y α4β7 (Humphries et al., 1986). Recientemente, un nuevo sitio de unión a glicosaminoglicanos ha sido identificado dentro de IIICS, mostrando que la cooperación entre los proteoglicanos de superficie y las integrinas es importante para mediar la adhesión de las células a FN (Mostafavi-Pour et al., 2001). La señalización cooperativa a partir de las integrinas α5β1 y α4β1 ha sido propuesta para modular la expresión de metaloproteinasas tales como la colagenasa, la gelatinasa de 92-kDa y la stromelisina-1 en respuesta a FN (Huhtala et al., 1995). Por lo tanto, la inclusión o exclusión de EDI y IIICS en el mRNA maduro de FN puede generar o remover sitios de reconocimiento para integrinas, alterando el comportamiento celular. Los resultados de los experimentos con Act D nos permiten descartar la posibilidad de que el efecto de los FC en el patrón de isoformas alternativas estuviera causado por una estabilidad diferencial de las diferentes isoformas de mRNA. El análisis del patrón de isoformas alternativas en el núcleo y en el citosol nos permite, en principio, descartar procesos de exportación diferencial de ambas isoformas. Hemos encontrado que estos efectos no dependen de la síntesis de novo de proteínas, dado que no son bloqueados por un inhibidor de la traducción como CHX. El hecho de que la CHX potencie el efecto de los FC sugiere que podría estar activando una vía de transducción de señales Discusión 104 sinergística (La CHX puede estimular vías de señalización por estrés celular), o inhibiendo una represora o, alternativamente, bloqueando la síntesis de una proteína inhibitoria (Blaustein et al., 2004). HGF/SF actúa a través del RTK Met, expresado en células epiteliales. Es sabido que la vía de PI(3)K es activada río abajo de Met y es requerida para la inducción de la tubulogénesis y la motilidad celular por HGF/SF. Sin embargo, otros procesos como la ramificación morfogenética, si bien inducidos por la actividad constitutiva de PI(3)K, son dependientes de la vía de ERK. Más aún, el desensamblado de las uniones adherentes inducido por HGF/SF requiere la activación de Ras-ERK río abajo de Met (Rosario y Birchmeier, 2003). Las quinasas de estrés p38 y JNK son también activadas ocasionalmente por FC (Recio y Merlino, 2002). Ciertamente, el orquestado de respuestas celulares complejas requiere la activación de diferentes cascadas de señalización y es necesaria una importante interacción entre ellas, haciendo la disección de cada vía involucrada una tarea difícil. Nuestros resultados revelan que la vía de RasPI(3)K-AKT/PKB es clave para conectar HGF/SF con la maquinaria nuclear de splicing (Blaustein et al., 2004; Blaustein et al., 2005). Aquí, a diferencia de lo observado en experimentos con inhibidores de la vía de JNK, p38 y MEKERK, mostramos que un inhibidor de la vía de PI(3)K es capaz de bloquear drásticamente los efectos producidos por los FC sobre el splicing alternativo de FN EDI y IIICS. Esto demuestra un papel protagónico de la vía de PI(3)K y revela parte de la hasta aquí desconocida cascada de señales que media la regulación del splicing alternativo de FN. El hecho de que los efectos del MCmes no son totalmente inhibidos por LY en contraste con el efecto mediado por HGF/SF, junto a la observación de que es necesario agregar también un bloqueante de la vía de MEK-ERK, sugiere que existe/n activador/es en el MCmes que contribuye/n al aumento de inclusión de EDI por medio de ambas cascadas de señalización. Por otro lado, y complementando estos resultados, la sobre-expresión de los mutantes constitutivamente activos de Ras (que se encuentra río arriba de PI(3)K), Ras(V12) y Ras(V12C40), así como la sobreexpresión de un mutante constitutivamente activo de AKT/PKB (que se encuentra río abajo de PI(3)K), AKT Myr, son suficientes para reproducir el efecto de los FC, a diferencia de lo observado para la sobre-expresión de Rac(QL). Utilizando una estrategia de RNAi, hemos encontrado que mientras que 9G8 tiene un importante papel en transducir la información desde el medio extracelular, SF2/ASF es requerido tanto para los niveles de inclusión basal de Discusión 105 EDI como para el aumento de estos niveles de inclusión por FC. SC35, por el contrario no parece ser relevante para la regulación estudiada. Esta aproximación, nos permitió disectar qué proteínas SR, de entre las que eran capaces de alterar el splicing alternativo de EDI por sobre-expresión (Cramer et al., 1999), son requeridas para esta regulación fisiológica. El papel de 9G8 está robustecido por el hecho de que el splicing alternativo de un exón EDII al que se le agregó un ESE para 9G8 se vuelve capaz de ser afectado por las señales extracelulares estudiadas. Es concebible que la depleción de SF2/ASF por RNAi pueda en realidad estar inhibiendo la regulación de EDI inducida por FC o por AKT/PKB al prevenir la interacción entre 9G8 y el spliceosoma. En este sentido, se ha encontrado que estas dos proteínas SR interactúan para activar el splicing dependiente del ISE del intrón D del pre-mRNA de la hormona de crecimiento bovina (Li et al., 2000). Dado que el dominio RS de las proteínas SR contiene varios motivos consenso para la fosforilación de AKT/PKB, ésta resulta ser una potencial quinasa de proteínas SR. Nuestros datos proveen evidencia in vivo e in vitro a favor de un papel directo de AKT/PKB en la modificación de la actividad de SF2/ASF y de 9G8. Paralelamente, y de modo consistente con estas conclusiones, se encontró independientemente que AKT/PKB puede fosforilar a la proteína SR SRp40 y modificar el splicing alternativo del pre-mRNA de PKCβII (Patel et al., 2005). Sin embargo, nuestros datos indicarían que SRp40 no participa en la regulación presentada aquí, dado que el splicing alternativo de EDII es regulado por SRp40 (Du et al., 1997) y sin embargo no es modificado por FC. Nuevos experimentos serán necesarios para determinar si AKT/PKB fosforila a las proteínas SR en el núcleo, en el citoplasma o en ambos compartimentos. La posibilidad de que dicha fosforilación tenga lugar en el citoplasma sería compatible con nuevas evidencias que indican que las proteínas SR dejan el núcleo en un estado hipofosforilado (Huang y Steitz, 2001; Huang et al., 2003; Gilbert y Guthrie, 2004) y que muestran que la fosforilación de las proteínas SR es necesaria para la importación de las mismas al núcleo, (Lai et al., 2000; Lai et al., 2001). Dado que la sobre-expresión de las quinasas SRPK y Clk, por el contrario, lleva a una localización anómala e incluso citoplasmática de las proteínas SR, AKT/PKB parece un buen candidato para aumentar la importación nuclear de las mismas. Por lo tanto, será interesante averiguar si la actividad de AKT/PKB afecta la reimportación de las proteínas SR al núcleo, sus propiedades de unión al RNA y/o su eficiencia en favorecer el splicing y la traducción. En referencia a este punto, encontramos efectos opuestos sobre el Discusión 106 splicing alternativo al sobre-expresar AKT/PKB por un lado y al sobre-expresar SRPK o Clk por el otro. No se puede descartar, sin embargo, la posibilidad de que los resultados obtenidos se deban a que la sobre-expresión de estas últimas quinasas cause una hiperfosforilación de las proteínas SR que vaya más allá de los niveles fisiológicos y que por lo tanto se esté provocando la inactivación de las mismas (Prasad et al., 1999). De cualquier modo, es tentador especular que el balance de las actividades de todas estas quinasas y las concomitantes interacciones con las proteínas SR pueda determinar la actividad de las proteínas SR y por ende, alterar procesos río abajo de las mismas. AKT/PKB aumenta la traducción a nivel del reclutamiento dependiente de cap de los RNAs a los polisomas, modificando la actividad de factores de iniciación de la traducción. La señalización de la cascada de PI(3)K-AKT/PKB lleva a la fosforilación e inactivación de represores de la traducción, las proteínas de unión a eIF4E, e involucra la actividad de mTor (Gingras et al., 1998). Además, nuestros resultados indican una nueva actividad de AKT/PKB relacionada con la traducción que requiere la interacción de las proteínas SR con el mRNA. En este sentido, nuestras observaciones mostrando que los FC y AKT/PKB pueden alterar la traducción de una manera dependiente de proteínas SR no sólo confirman la existencia de funciones citoplasmáticas de las proteínas SR (Sanford et al., 2004; Sanford et al., 2005; Swartz et al., 2007) sino que prueban que estas funciones son finamente reguladas en respuesta a información extracelular. En conclusión, los FC tienen un profundo impacto sobre la regulación de la actividad nuclear y citoplasmática de las proteínas SR, es decir, sobre la regulación del splicing alternativo y la traducción. Estos resultados, basados en el análisis de transcriptos derivados de genes endógenos o de minigenes transfectados transitoriamente, así como en experimentos de knock-down y de sobre-expresión de proteínas, son consistentes con un modelo en el cual los agentes mitogénicos actúan a través de la vía de Ras-PI(3)K-AKT/PKB para alterar las actividad de las proteínas SR (Blaustein et al., 2004; Blaustein et al., 2005). Esto produce como consecuencia cambios en el metabolismo del mRNA a dos niveles diferentes, resultando en la regulación orquestada de dos procesos fisiológicos clave: el splicing alternativo y la traducción (Fig. 33). Los niveles incrementados de mRNA conteniendo ESEs serían el resultado del primer paso regulado. En el segundo paso, la presencia de proteínas SR unidas al transcripto convertiría a esta molécula en un mejor templado para la Discusión 107 traducción. Esto serviría s para aumentar tan nto la velocid dad como la fuerza f de la respuuesta a la señaalización evaluada como laa producción n de la proteín na inducida. Figura 33 3: Regulación del d metabolism mo del mRNA de d FN. Luego de d la unión de lo os FC a sus recceptores de sup perficie se activa Rass, intercambiand do GDP por GT TP y a su vez esstimula a PI(3)K K y a la vía de Raf-MEK-ERK R (la vía de señalización de los FC ess ilustrada con n flechas colorr sepia). PI(3)K K genera inosittol fosfolípidos específicos qu ue son reconocidos por AKT/PKB,, la cual translo oca a la memb brana donde re esulta activada. La fosforilació ón inducida por AKT/PKB esttimula las actividade es nucleares y citoplasmáticass de las proteín nas SR, favorec ciéndose la incclusión de EDI en el mRNA maduro m (el destino de el mRNA es essquematizado por p flechas negrras entrecortadas). Durante la reacción de sp plicing, las protteínas SR son defossforiladas y exportadas al citop plasma junto al mRNA. Finalm mente, las proteínas SR aumen ntan la traducción de los mRNA co onteniendo ESE E (derecha) pero no de aque ellos que carec cen de los mismos (izquierda a), luego de lo cual son liberadas para participar en e ciclos subse ecuentes (el ciclo o de las proteín nas SR es ilustra ado con flechass negras sólidas s). Discuusión 108 La respuesta sería rápida, porque la traducción de cualquier mRNA preexistente conteniendo el exón alternativo sería incrementada preferencial e inmediatamente; sería fuerte porque más mRNAs conteniendo el exón alternativo serían producidos y estos, a su vez, serían traducidos más eficientemente (Graveley, 2005). Queda planteado el desafío de hallar, en un futuro próximo, genes endógenos y contextos fisiológicos para los cuales pueda ser relevante esta doble regulación de la expresión génica ejercida por las proteínas SR. Es de destacar, en este sentido, el reciente hallazgo que muestra que la unión de FN a integrinas β1 es capaz de aumentar la traducción dependiente de cap, vía PI(3)K (Gorrini et al., 2005). Esto es de especial interés sobre todo teniendo en cuenta nuestros experimentos mostrando que la inclusión de los exones alternativos EDI y IIICS en la proteína madura es exacerbada por esta misma vía de señalización y dado que la inclusión de estos exones genera una FN con mayor capacidad de unión a las integrinas α4β1, α5β1 y α9β1. Esto habla a las claras de un potencial mecanismo de retroalimentación positiva. Finalmente, describimos que SF2/ASF puede regular la traducción alternativa (Blaustein et al., manuscrito enviado para su publicación). La sobreexpresión de SF2/ASF aumenta el cociente de traducción dependiente de cap versus dependiente de IRES en mRNAs derivados de minigenes bicistrónicos transfectados transitoriamente. Estos resultados fueron observados para dos IRESs eucariotas celulares derivados de los genes cat1 y BiP y para el IRES viral de HCV. De modo coherente, la depleción de SF2/ASF por RNAi produce una disminución del cociente de traducción dependiente de cap versus dependiente de IRES, no sólo en reporteros bicistrónicos sino también en un transcripto endógeno como es el caso del mRNA de FGF-2. Los resultados presentados aquí no responden si los efectos ejercidos por SF2/ASF en la traducción alternativa son causados por una unión directa al mRNA. Sin embargo, la inserción de sitios de unión de SF2/ASF en un reportero de LUC aumenta la traducción dependiente de cap in vivo (Sanford et al., 2004). Más aún, experimentos de traducción in vitro muestran que el agregado de SF2/ASF recombinante aumenta la traducción dependiente de cap (Sanford et al., 2004), sugiriendo un papel directo para SF2/ASF en la traducción de los mRNAs estudiados. No obstante, no se pueden descartar hasta aquí efectos de SF2/ASF que puedan ser independientes de su unión a los Discusión 109 reporteros utilizados en este trabajo. En este sentido, ha sido recientemente demostrado que la sobre-expresión de SF2/ASF en células en cultivo regula el patrón de splicing de los pre-mRNAs transcriptos a partir de los genes RPS6KB1 y MNK2. Las proteínas codificadas por ambos genes están involucradas en la regulación de la traducción. El primer gen codifica para S6K1, una quinasa que fosforila a la proteína S6 de la subunidad menor del ribosoma, mientras que el segundo codifica para una de las dos quinasas que se sabe son capaces de fosforilar al factor de iniciación de la traducción 4E, una proteína capaz de unirse a cap (Karni et al., 2007). Nuestros experimentos in vivo apoyan fuertemente la hipótesis de que SF2/ASF regula la traducción al nivel de la iniciación de la traducción. Resulta destacable el hecho de que haya sido reportado que varias proteínas SR se inactivan por defosforilación durante la infección de tres familias diferentes de virus: adenovirus (Kanopka et al., 1998), vaccinia virus (Huang et al., 2002) y herpes simplex virus (Sciabica et al., 2003). Estos estudios probaron que el splicing del pre-mRNA puede ser un blanco común de la interferencia viral. Las estrategias de infección viral están normalmente asociadas con la inhibición de diferentes pasos del metabolismo celular de modo de maximizar la replicación viral. La interferencia viral con la actividad de las proteínas SR sería entonces un mecanismo importante en el remodelado de la maquinaria de expresión génica del hospedador. De hecho, los picornavirus, flavivirus, retrovirus y algunos DNA virus inhiben la traducción dependiente de cap de la célula hospedadora como una estrategia de infección clave (Vagner et al., 2001). Nuestros resultados predicen que luego de la infección por estas últimas familias de virus podría tener lugar la inactivación de SF2/ASF. Sin embargo, en este caso, la inactivación de SF2/ASF sería importante no tanto para interferir con la maquinaria de splicing como para reprimir la maquinaria de traducción dependiente de cap de la célula favoreciendo la traducción dependiente de IRES de los RNAs virales. En esta línea de evidencia, y como se ha descripto líneas arriba, tanto SF2/ASF como AKT/PKB son capaces, por sobre-expresión o activación, de potenciar la inclusión de ciertos exones alternativos y de estimular la traducción dependiente de cap. Notablemente, se ha encontrado que el interferón-α, un conocido factor antiviral, promueve la supervivencia celular activando la vía de AKT/PKB (Yang et al., 2001) e inhibe la traducción dependiente de IRES en seis genotipos diferentes de HCV (Hazari et al., 2005). Por lo tanto, será de enorme interés buscar un papel para las proteínas SR como blancos potenciales de la vía de AKT/PKB en la Discusión 110 regulación de la traducción. La traducción independiente de cap no está restringida a RNAs virales. Como fue mencionado para el caso de cat1, BiP y FGF-2, varios mRNAs eucariotas poseen secuencias IRESs. Se ha demostrado que la traducción alternativa es fisiológicamente regulada durante la mitosis, quiescencia, diferenciación y en respuesta a estrés (Vagner et al., 2001). Por lo tanto, la alteración de la actividad de las proteínas SR, que ha sido asociada a cambios en el splicing alternativo en todos estos procesos (Blaustein et al., 2007), debería ser también investigada dentro del campo de la regulación de la traducción. En este sentido, la proteína SR SRp38 ha sido caracterizada como un represor general del splicing que es activado por defosforilación en células sometidas a estrés térmico así como en células en fase M. SRp38 defosforilada interactúa fuertemente con U1 snRNP interfiriendo con el reconocimiento de los ss 5´ (Shin et al., 2004). SRp38 co-localiza con U1 snRNP no sólo en el núcleo sino también en el citoplasma, lo que lleva a la especulación de que estas estructuras que contienen a ambas proteínas podrían corresponder a gránulos de estrés, dominios citoplasmáticos que albergan mRNAs arrestados traduccionalmente, y por lo tanto SRp38 podría estar actuando en la represión traduccional en respuesta al estrés térmico (Shin et al., 2005). Más aún, trabajos recientes han mostrado que un aumento en la fosforilación de hnRNP A1 en respuesta a estrés osmótico conlleva la acumulación de esta proteína unida a mRNAs que son reclutados a los gránulos de estrés (Guil et al., 2006). En concordancia con nuestros hallazgos reportando la participación de factores de splicing en la traducción alternativa, pero modificando la traducción alternativa en un sentido inverso al que nosotros encontramos, el grupo de Semler ha descripto recientemente que la proteína SRp20 favorece la traducción dependiente de IRES de poliovirus (Bedard et al., 2007). En el mismo sentido, hnRNP A1 es capaz de aumentar la traducción dependiente de IRES de FGF-2 (Bonnal et al., 2005). Al igual que lo que ocurre en la regulación del splicing alternativo, cada proteína SR y cada hnRNP puede influir positiva o negativamente, según el caso estudiado. La relevancia del acoplamiento entre los procesos de splicing alternativo y de traducción alternativa se pone de manifiesto en un trabajo reciente que muestra que la actividad del IRES de la ornitina decarboxilasa es incrementada luego de la inclusión de secuencias alternativas generadas por splicing en ss crípticos. Más aún, este IRES se vuelve más sensible a cambios dependientes del ciclo celular en la tasa de traducción (Pyronnet et al., 2005). Esta regulación Discusión 111 resulta de particular importancia en cuanto conlleva la acumulación de la proteína ornitina decarboxilasa, capaz de contribuir a la transformación celular. Por ende, el nivel de expresión, junto con el balance de fosforilación/activación de ciertas proteínas SR y hnRNPs, pueden ser blancos clave no sólo para la regulación del splicing sino para la regulación de la traducción alternativa y, en particular, para estrategias virales y antivirales. En definitiva, al día de la fecha sabemos que muchas cascadas de señalización (Tabla I) controlan la regulación del metabolismo del RNA (van der Houven van Oordt et al., 2000; Patel et al., 2001; Matter et al., 2002; Srebrow et al., 2002; Xie et al., 2003; Blaustein et al., 2004; Shin et al., 2004; Allemand et al., 2005; Blaustein et al., 2005; Buxade et al., 2005; Patel et al., 2005; Pelisch et al., 2005; Rothrock et al., 2005; Shin et al., 2005; Batsche et al., 2006; Cheng y Sharp, 2006; House y Lynch, 2006; Thornton et al., 2006; Lee et al., 2007; Melton et al., 2007) y que las células utilizan un determinado repertorio de moléculas de señalización para transducir la información desde el medio extracelular y regular la expresión génica a diferentes niveles incluyendo, entre otros, la actividad transcripcional del promotor, el procesamiento del pre-mRNA, la exportación del mRNA, su estabilidad y su traducción. El panorama es aún más complejo si consideramos que estos niveles pueden influirse mutuamente o pueden tener lugar de una manera concertada (Cramer et al., 1997; Cramer et al., 1999; Cramer et al., 2001; Kadener et al., 2001; Kadener et al., 2002; Nogués et al., 2002; de la Mata et al., 2003; Nogues et al., 2003; Blaustein et al., 2004; Kornblihtt et al., 2004; Fededa et al., 2005; Graveley, 2005; de la Mata y Kornblihtt, 2006; Kornblihtt, 2006). Otros niveles adicionales de complejidad pueden existir, derivados de la extensa comunicación entre diferentes vías de señalización que tiene lugar cuando las células responden a múltiples señales simultáneamente. Hemos aprendido de los operones bacterianos que un estímulo externo puede regular la transcripción de varios genes que codifican para componentes proteicos de una misma vía metabólica. Es probable que esta situación pueda ser extrapolada a organismos multicelulares y encontrar que una determinada señal extracelular afecta varios eventos de splicing en una variedad de premRNAs de modo de regular una función celular completa o de coordinar diferentes funciones, por ejemplo por fosforilación de un determinado factor de splicing. De hecho, se ha reportado que un grupo de exones alternativos regulados por depolarización y probablemente involucrados en la función neuronal poseen elementos de RNA capaces de sensar la actividad de la proteína quinasa dependiente de Ca2+/calmodulina o CaMK IV (Lee et al., Discusión 112 2007). Más aún, se ha demostrado que un factor de splicing neuronal específico llamado Nova regula el splicing alternativo de un grupo de transcriptos que codifican para una red de proteínas capaces de interactuar entre sí y que funcionan en la sinapsis (Ule et al., 2005; Ule y Darnell, 2006). Gen Función de la proteína Exón Estímulo Slo Canal de potasio BK STREX Depolarización NR1 Subunidad de NMDAR involucrada en procesos neuronales 21 Depolarización Molécula de superficie involucrada en proliferación, supervivencia y diferenciación CD44 22 v5 Activación/ inhibición de la actividad neuronal Activación de las células T Proteínas de señalización CaMK IV Factores de splicing ? CaMK IV ? ? ? Tabla I: Señales extracelulares, señalización Ras-RafMEKERK Sam68, SRm160 y hnRNP A1 y splicing alternativo. Resumen de los sistemas modelo utilizados para disectar los efectos de las señales extracelulares que Fosfatasa de tirosinas transmembrana CD45 Glicoproteína de la matriz extracelular involucrada en comportamientos adhesivos y migratorios FN PKC Proteína de señalización E1A Proteína de adenovirus involucrada en la regulación de la transcripción y de la síntesis de DNA v6 4,5 y 6 EDI y IIICS Suero, FC Activación de las células T Membrana basal rica en laminina Sitios de splicing alternativos JNK y ERK ? hnRNP L y otros ? repercuten en la regulación del splicing alternativo y sus vías de transducción de señales asociadas. Los colores de fondo indican moléculas de señalización compartidas por diferentes FC βII Ras-ERK Ras Insulina Estrés osmótico o radiación UVC RasPI(3)KAKT/ PKB PI(3)KAKT/ PKB MKK3/6p38Mnk1/2 SF2/ASF y 9G8 procesos de regulación del (determinado sólo para EDI) respuesta a señales SRp40 splicing alternativo en extracelulares. hnRNP A1 De modo similar, pero en un sentido más restringido, el control de la elongación transcripcional puede modular el splicing alternativo de varios exones en el mismo gen (Fededa et al., 2005). Finalmente, la arquitectura global del genoma parece ser un nivel clave para la coordinación del splicing alternativo. Una característica distintiva del núcleo de células de mamífero es la presencia de dominios estructurales y funcionales que carecen de fronteras membranosas. La organización espacial Discusión 113 del genoma es establecida por arreglos no aleatorios de cromosomas en el núcleo en interfase, con cromosomas ocupando posiciones intranucleares preferenciales (Lamond y Earnshaw, 1998; Gorski y Misteli, 2005). Por lo tanto, los speckles podrían estar distribuidos en el núcleo de modo de orquestar el splicing alternativo de moléculas de pre-mRNA transcriptas a partir de genes que co-localizan en la misma región cromatínica. La integración de los procesos nucleares descriptos y la adquisición de una visión del núcleo desde la perspectiva de la biología de sistemas es un campo emergente y su estudio presenta un atractivo desafío para los investigadores especializados en este área de la biología molecular y celular (Hieronymus y Silver, 2004). También en este sentido, resulta más que atractivo realizar un estudio a nivel de las poblaciones celulares. Poco se sabe acerca de la variación del splicing alternativo célula-célula, dentro de un grupo de células respondiendo a un determinado estímulo extracelular (Fededa y Colman-Lerner, resultados no publicados). Dada la necesidad de orquestar el comportamiento de varios tipos y linajes celulares diferentes, los sistemas de señalización son vitales para la función de los organismos multicelulares. Al menos el 15% de la capacidad de codificación de proteínas de vertebrados está destinada a receptores, componentes del sistema de señalización y proteínas reguladoras de la transcripción (Manning et al., 2002; Bertrand et al., 2004; Koonin et al., 2004; Zhang et al., 2006). Teniendo en cuenta la importancia de la señalización en el desarrollo y función de los metazoos, no es sorprendente que su disfunción se encuentre asociada a patologías. En el caso del cáncer, los cambios en la función de los sistemas de señalización son tan importantes que constituyen uno de los modos más usuales para definir y clasificar los diferentes tipos de cáncer (Hanahan y Weinberg, 2000). El diseño de drogas para inhibir la actividad de las moléculas de señalización es una de las técnicas más relevantes hoy día en la terapia contra el cáncer (Sebolt-Leopold y English, 2006). Es sabido que la desregulación de las vías de señalización ocurre en una amplia variedad de tumores humanos y también que el patrón de splicing de diferentes genes es alterado en esta compleja patología (Faustino y Cooper, 2003; Brinkman, 2004; Srebrow y Kornblihtt, 2006; Venables, 2006; Pajares et al., 2007). Existen varios ejemplos en los cuales determinadas isoformas de splicing se acumulan en los tumores y la sobre-expresión de la isoforma asociada al tumor es suficiente para transformar células en cultivo (Collesi et al., 1996; Zhou et al., 2003; Singh et al., 2004; Radisky et al., 2005). El análisis del patrón de splicing específico de distintos tumores y sus consecuencias moleculares es Discusión 114 prometedor y el uso del splicing alternativo como fuente potencial para nuevas herramientas diagnósticas, pronósticas, predictivas y terapéuticas para el cáncer resulta, hoy por hoy, muy atractivo (Pajares et al., 2007). Evidentemente, más trabajo es necesario para definir cómo diferentes redes de señalización controlan de modo preciso la actividad de los factores de splicing y cuáles son las consecuencias de su desregulación en los patrones de splicing de las células, los tejidos y, en última instancia, los organismos multicelulares. Discusión 115 BIBLIOGRAFÍA Ahmed, N. N., H. L. Grimes, A. Bellacosa, T. O. Chan y P. N. Tsichlis (1997). "Transduction of interleukin-2 antiapoptotic and proliferative signals via Akt protein kinase." Proc Natl Acad Sci U S A 94(8): 3627-32. Akiyama, S. K., K. Olden y K. M. Yamada (1995). "Fibronectin and integrins in invasion and metastasis." Cancer Metastasis Rev 14(3): 173-89. Allemand, E., S. Guil, M. Myers, J. Moscat, J. F. Caceres y A. R. Krainer (2005). "Regulation of heterogenous nuclear ribonucleoprotein A1 transport by phosphorylation in cells stressed by osmotic shock." Proc Natl Acad Sci U S A 102(10): 3605-10. Arai, H., H. Hirano, S. Mushiake, M. Nakayama, G. Takada y K. Sekiguchi (1997). "Loss of EDB+ fibronectin isoform is associated with differentiation of alveolar epithelial cells in human fetal lung." Am J Pathol 151(2): 403-12. Ares, M., Jr., L. Grate y M. H. Pauling (1999). "A handful of intron-containing genes produces the lion's share of yeast mRNA." RNA 5(9): 1138-9. Barnes, J. L., R. R. Hastings y M. A. De la Garza (1994). "Sequential expression of cellular fibronectin by platelets, macrophages, and mesangial cells in proliferative glomerulonephritis." Am J Pathol 145(3): 585-97. Barone, M. V., C. Henchcliffe, F. E. Baralle y G. Paolella (1989). "Cell type specific trans-acting factors are involved in alternative splicing of human fibronectin pre-mRNA." Embo J 8(4): 1079-85. Batsche, E., M. Yaniv y C. Muchardt (2006). "The human SWI/SNF subunit Brm is a regulator of alternative splicing." Nat Struct Mol Biol 13(1): 22-9. Bedard, K. M., S. Daijogo y B. L. Semler (2007). "A nucleo-cytoplasmic SR protein functions in viral IRESmediated translation initiation." EMBO J 26(2): 459-67. Berget, S. M., C. Moore y P. A. Sharp (1977). "Spliced segments at the 5' terminus of adenovirus 2 late mRNA." Proc Natl Acad Sci U S A 74(8): 3171-5. Bertrand, S., F. G. Brunet, H. Escriva, G. Parmentier, V. Laudet y M. Robinson-Rechavi (2004). "Evolutionary genomics of nuclear receptors: from twenty-five ancestral genes to derived endocrine systems." Mol Biol Evol 21(10): 1923-37. Black, D. L. (2000). "Protein diversity from alternative splicing: a challenge for bioinformatics and post-genome biology." Cell 103(3): 367-70. Black, D. L. (2003). "Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing." Annu Rev Biochem 72: 291336. Blaustein, M., F. Pelisch, O. A. Coso, M. J. Bissell, A. R. Kornblihtt y A. Srebrow (2004). "Mammary epithelial-mesenchymal interaction regulates fibronectin alternative splicing via phosphatidylinositol 3kinase." J Biol Chem 279(20): 21029-37. Blaustein, M., F. Pelisch y A. Srebrow (2007). "Signals, pathways and splicing regulation." Int J Biochem Cell Biol 39(11): 2031-2048. Bibliografía 117 Blaustein, M., F. Pelisch, T. Tanos, M. J. Munoz, D. Wengier, L. Quadrana, J. R. Sanford, J. P. Muschietti, A. R. Kornblihtt, J. F. Caceres, O. A. Coso y A. Srebrow (2005). "Concerted regulation of nuclear and cytoplasmic activities of SR proteins by AKT." Nat Struct Mol Biol 12(12): 1037-44. Bonnal, S., F. Pileur, C. Orsini, F. Parker, F. Pujol, A. C. Prats y S. Vagner (2005). "Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 is a novel internal ribosome entry site trans-acting factor that modulates alternative initiation of translation of the fibroblast growth factor 2 mRNA." J Biol Chem 280(6): 4144-53. Bork, P. y R. F. Doolittle (1992). "Proposed acquisition of an animal protein domain by bacteria." Proc Natl Acad Sci U S A 89(19): 8990-4. Bos, J. L. (1989). "ras oncogenes in human cancer: a review." Cancer Res 49(17): 4682-9. Boudrez, A., M. Beullens, P. Groenen, A. Van Eynde, V. Vulsteke, I. Jagiello, M. Murray, A. R. Krainer, W. Stalmans y M. Bollen (2000). "NIPP1-mediated interaction of protein phosphatase-1 with CDC5L, a regulator of pre-mRNA splicing and mitotic entry." J Biol Chem 275(33): 25411-7. Bourgeois, C. F., F. Lejeune y J. Stevenin (2004). "Broad specificity of SR (serine/arginine) proteins in the regulation of alternative splicing of pre-messenger RNA." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 78: 3788. Brinkman, B. M. (2004). "Splice variants as cancer biomarkers." Clin Biochem 37(7): 584-94. Brown, L. F., D. Dubin, L. Lavigne, B. Logan, H. F. Dvorak y L. Van de Water (1993). "Macrophages and fibroblasts express embryonic fibronectins during cutaneous wound healing." Am J Pathol 142(3): 793-801. Buratti, E. y F. E. Baralle (2004). "Influence of RNA secondary structure on the pre-mRNA splicing process." Mol Cell Biol 24(24): 10505-14. Buratti, E., A. F. Muro, M. Giombi, D. Gherbassi, A. Iaconcig y F. E. Baralle (2004). "RNA folding affects the recruitment of SR proteins by mouse and human polypurinic enhancer elements in the fibronectin EDA exon." Mol Cell Biol 24(3): 1387-400. Buxade, M., J. L. Parra, S. Rousseau, N. Shpiro, R. Marquez, N. Morrice, J. Bain, E. Espel y C. G. Proud (2005). "The Mnks are novel components in the control of TNF alpha biosynthesis and phosphorylate and regulate hnRNP A1." Immunity 23(2): 177-89. Cáceres, J. F., T. Misteli, G. R. Screaton, D. L. Spector y A. R. Krainer (1997). "Role of the modular domains of SR proteins in subnuclear localization and alternative splicing specificity." J Cell Biol 138(2): 225-38. Cáceres, J. F., G. R. Screaton y A. R. Krainer (1998). "A specific subset of SR proteins shuttles continuously between the nucleus and the cytoplasm." Genes Dev 12(1): 55-66. Cáceres, J. F., S. Stamm, D. M. Helfman y A. R. Krainer (1994). "Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors." Science 265(5179): 1706-9. Bibliografía 118 Caputi, M., G. Casari, S. Guenzi, R. Tagliabue, A. Sidoli, C. A. Melo y F. E. Baralle (1994). "A novel bipartite splicing enhancer modulates the differential processing of the human fibronectin EDA exon." Nucleic Acids Res 22(6): 1018-22. Cartegni, L., S. L. Chew y A. R. Krainer (2002). "Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing." Nat Rev Genet 3(4): 285-98. Cartegni, L., J. Wang, Z. Zhu, M. Q. Zhang y A. R. Krainer (2003). "ESEfinder: A web resource to identify exonic splicing enhancers." Nucleic Acids Res 31(13): 3568-71. Cavaloc, Y., C. F. Bourgeois, L. Kister y J. Stevenin (1999). "The splicing factors 9G8 and SRp20 transactivate splicing through different and specific enhancers." Rna 5(3): 468-83. Colman-Lerner, A., M. L. Fischman, G. M. Lanuza, D. M. Bissell, A. R. Kornblihtt y J. L. Barañao (1999). "Evidence for a role of the alternatively spliced ED-I sequence of fibronectin during ovarian follicular development." Endocrinology 140(6): 2541-8. Colwill, K., T. Pawson, B. Andrews, J. Prasad, J. L. Manley, J. C. Bell y P. I. Duncan (1996). "The Clk/Sty protein kinase phosphorylates SR splicing factors and regulates their intranuclear distribution." Embo J 15(2): 265-75. Collesi, C., M. M. Santoro, G. Gaudino y P. M. Comoglio (1996). "A splicing variant of the RON transcript induces constitutive tyrosine kinase activity and an invasive phenotype." Mol Cell Biol 16(10): 5518-26. Cramer, P., J. F. Cáceres, D. Cazalla, S. Kadener, A. F. Muro, F. E. Baralle y A. R. Kornblihtt (1999). "Coupling of transcription with alternative splicing: RNA pol II promoters modulate SF2/ASF and 9G8 effects on an exonic splicing enhancer." Mol Cell 4(2): 251-8. Cramer, P., C. G. Pesce, F. E. Baralle y A. R. Kornblihtt (1997). "Functional association between promoter structure and transcript alternative splicing." Proc Natl Acad Sci U S A 94(21): 11456-60. Cramer, P., A. Srebrow, S. Kadener, S. Werbajh, M. de la Mata, G. Melen, G. Nogués y A. R. Kornblihtt (2001). "Coordination between transcription and pre-mRNA processing." FEBS Lett 498(2-3): 179-82. Chalfant, C. E., B. Ogretmen, S. Galadari, B. J. Kroesen, B. J. Pettus y Y. A. Hannun (2001). "FAS activation induces dephosphorylation of SR proteins; dependence on the de novo generation of ceramide and activation of protein phosphatase 1." J Biol Chem 276(48): 44848-55. Chalfant, C. E., K. Rathman, R. L. Pinkerman, R. E. Wood, L. M. Obeid, B. Ogretmen y Y. A. Hannun (2002). "De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1." J Biol Chem 277(15): 12587-95. Chang, L. y M. Karin (2001). "Mammalian MAP kinase signalling cascades." Nature 410(6824): 37-40. Chauhan, A. K., A. Iaconcig, F. E. Baralle y A. F. Muro (2004). "Alternative splicing of fibronectin: a mouse model demonstrates the identity of in vitro and in vivo systems and the processing autonomy of regulated exons in adult mice." Gene 324: 55-63. Bibliografía 119 Chen, W. y L. A. Culp (1996). "Adhesion mediated by fibronectin's alternatively spliced EDb (EIIIB) and its neighboring type III repeats." Exp Cell Res 223(1): 9-19. Chen, W. y L. A. Culp (1998). "Adhesion to fibronectin's EDb domain induces tyrosine phosphorylation of focal adhesion proteins in Balb/c 3T3 cells." Clin Exp Metastasis 16(1): 30-42. Cheng, C. y P. A. Sharp (2006). "Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion." Mol Cell Biol 26(1): 362-70. Chomczynski, P. y N. Sacchi (1987). "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroform extraction." Anal Biochem 162(1): 156-9. Chow, L. T., R. E. Gelinas, T. R. Broker y R. J. Roberts (1977). "An amazing sequence arrangement at the 5' ends of adenovirus 2 messenger RNA." Cell 12(1): 1-8. Davis, R. J. (1993). "The mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway." J Biol Chem 268(20): 14553-6. de la Mata, M., C. R. Alonso, S. Kadener, J. P. Fededa, M. Blaustein, F. Pelisch, P. Cramer, D. Bentley y A. R. Kornblihtt (2003). "A slow RNA polymerase II affects alternative splicing in vivo." Mol Cell 12(2): 525-32. de la Mata, M. y A. R. Kornblihtt (2006). "RNA polymerase II C-terminal domain mediates regulation of alternative splicing by SRp20." Nat Struct Mol Biol 13(11): 973-980. Denegri, M., I. Chiodi, M. Corioni, F. Cobianchi, S. Riva y G. Biamonti (2001). "Stress-induced nuclear bodies are sites of accumulation of pre-mRNA processing factors." Mol Biol Cell 12(11): 3502-14. Desprez, P. Y., Roskelley, C., Campisi, J. and Bissell, M.J. (1993). "Isolation of functional cell lines from a mouse mammary epithelial cell strain: the importance of basement membrane and cell-cell interaction." Mol Cell Differenciation 1(1): 99-110. Dreyfuss, G., M. J. Matunis, S. Pinol-Roma y C. G. Burd (1993). "hnRNP proteins and the biogenesis of mRNA." Annu Rev Biochem 62: 289-321. Du, K., Y. Peng, L. E. Greenbaum, B. A. Haber y R. Taub (1997). "HRS/SRp40-mediated inclusion of the fibronectin EIIIB exon, a possible cause of increased EIIIB expression in proliferating liver." Mol Cell Biol 17(7): 4096-104. Duncan, P. I., D. F. Stojdl, R. M. Marius, K. H. Scheit y J. C. Bell (1998). "The Clk2 and Clk3 dualspecificity protein kinases regulate the intranuclear distribution of SR proteins and influence pre-mRNA splicing." Exp Cell Res 241(2): 300-8. Enard, W., P. Khaitovich, J. Klose, S. Zollner, F. Heissig, P. Giavalisco, K. Nieselt-Struwe, E. Muchmore, A. Varki, R. Ravid, G. M. Doxiadis, R. E. Bontrop y S. Paabo (2002). "Intraand interspecific variation in primate gene expression patterns." Science 296(5566): 340-3. English, J., G. Pearson, J. Wilsbacher, J. Swantek, M. Karandikar, S. Xu y M. H. Cobb (1999). "New insights into the control of MAP kinase pathways." Exp Cell Res 253(1): 255-70. Faustino, N. A. y T. A. Cooper (2003). "Pre-mRNA splicing and human disease." Genes Dev 17(4): 41937. Bibliografía 120 Fededa, J. P., E. Petrillo, M. S. Gelfand, A. D. Neverov, S. Kadener, G. Nogues, F. Pelisch, F. E. Baralle, A. F. Muro y A. R. Kornblihtt (2005). "A polar mechanism coordinates different regions of alternative splicing within a single gene." Mol Cell 19(3): 393-404. Fernandez, J., I. Yaman, R. Mishra, W. C. Merrick, M. D. Snider, W. H. Lamers y M. Hatzoglou (2001). "Internal ribosome entry site-mediated translation of a mammalian mRNA is regulated by amino acid availability." J Biol Chem 276(15): 12285-91. ffrench-Constant, C., L. Van de Water, H. F. Dvorak y R. O. Hynes (1989). "Reappearance of an embryonic pattern of fibronectin splicing during wound healing in the adult rat." J Cell Biol 109(2): 90314. Fichter, M., R. Hinrichs, G. Eissner, B. Scheffer, S. Classen y M. Ueffing (1997). "Expression of CD44 isoforms in neuroblastoma cells is regulated by PI 3-kinase and protein kinase C." Oncogene 14(23): 2817-24. Fu, X. D., A. Mayeda, T. Maniatis y A. R. Krainer (1992). "General splicing factors SF2 and SC35 have equivalent activities in vitro, and both affect alternative 5' and 3' splice site selection." Proc Natl Acad Sci U S A 89(23): 11224-8. Ge, H. y J. L. Manley (1990). "A protein factor, ASF, controls cell-specific alternative splicing of SV40 early pre-mRNA in vitro." Cell 62(1): 25-34. Ge, H., P. Zuo y J. L. Manley (1991). "Primary structure of the human splicing factor ASF reveals similarities with Drosophila regulators." Cell 66(2): 373-82. George, E. L., E. N. Georges-Labouesse, R. S. Patel-King, H. Rayburn y R. O. Hynes (1993). "Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin." Development 119(4): 1079-91. George, J., S. S. Wang, A. M. Sevcsik, M. Sanicola, R. L. Cate, V. E. Koteliansky y D. M. Bissell (2000). "Transforming growth factor-beta initiates wound repair in rat liver through induction of the EIIIA-fibronectin splice isoform." Am J Pathol 156(1): 115-24. Gilbert, W. (1978). "Why genes in pieces?" Nature 271(5645): 501. Gilbert, W. y C. Guthrie (2004). "The Glc7p nuclear phosphatase promotes mRNA export by facilitating association of Mex67p with mRNA." Mol Cell 13(2): 201-12. Gingerich, T. J., J. J. Feige y J. LaMarre (2004). "AU-rich elements and the control of gene expression through regulated mRNA stability." Anim Health Res Rev 5(1): 49-63. Gingras, A. C., S. G. Kennedy, M. A. O'Leary, N. Sonenberg y N. Hay (1998). "4E-BP1, a repressor of mRNA translation, is phosphorylated and inactivated by the Akt(PKB) signaling pathway." Genes Dev 12(4): 502-13. Glukhova, M. A., M. G. Frid, B. V. Shekhonin, T. D. Vasilevskaya, J. Grunwald, M. Saginati y V. E. Koteliansky (1989). "Expression of extra domain A fibronectin sequence in vascular smooth muscle cells is phenotype dependent." J Cell Biol 109(1): 357-66. Bibliografía 121 Gorrini, C., F. Loreni, V. Gandin, L. A. Sala, N. Sonenberg, P. C. Marchisio y S. Biffo (2005). "Fibronectin controls cap-dependent translation through beta1 integrin and eukaryotic initiation factors 4 and 2 coordinated pathways." Proc Natl Acad Sci U S A 102(26): 9200-5. Gorski, S. y T. Misteli (2005). "Systems biology in the cell nucleus." J Cell Sci 118(Pt 18): 4083-92. Graveley, B. R. (2000). "Sorting out the complexity of SR protein functions." Rna 6(9): 1197-211. Graveley, B. R. (2001). "Alternative splicing: increasing diversity in the proteomic world." Trends Genet 17(2): 100-7. Graveley, B. R. (2005). "Coordinated control of splicing and translation." Nat Struct Mol Biol 12(12): 10223. Graveley, B. R. y T. Maniatis (1998). "Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing." Mol Cell 1(5): 765-71. Gui, J. F., H. Tronchere, S. D. Chandler y X. D. Fu (1994). "Purification and characterization of a kinase specific for the serine- and arginine-rich pre-mRNA splicing factors." Proc Natl Acad Sci U S A 91(23): 10824-8. Guil, S., J. C. Long y J. F. Caceres (2006). "hnRNP A1 relocalization to the stress granules reflects a role in the stress response." Mol Cell Biol 26(15): 5744-58. Gutman, A. y A. R. Kornblihtt (1987). "Identification of a third region of cell-specific alternative splicing in human fibronectin mRNA." Proc Natl Acad Sci U S A 84(20): 7179-82. Hanahan, D. (1983). "Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids." J Mol Biol 166(4): 55780. Hanahan, D. y R. A. Weinberg (2000). "The hallmarks of cancer." Cell 100(1): 57-70. Hastings, M. L. y A. R. Krainer (2001). "Pre-mRNA splicing in the new millennium." Curr Opin Cell Biol 13(3): 302-9. Hazari, S., A. Patil, V. Joshi, D. E. Sullivan, C. D. Fermin, R. F. Garry, R. M. Elliott y S. Dash (2005). "Alpha interferon inhibits translation mediated by the internal ribosome entry site of six different hepatitis C virus genotypes." J Gen Virol 86(Pt 11): 3047-53. Hellen, C. U. y P. Sarnow (2001). "Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules." Genes Dev 15(13): 1593-612. Hernandez, F., M. Perez, J. J. Lucas, A. M. Mata, R. Bhat y J. Avila (2004). "Glycogen synthase kinase-3 plays a crucial role in tau exon 10 splicing and intranuclear distribution of SC35. Implications for Alzheimer's disease." J Biol Chem 279(5): 3801-6. Hieronymus, H. y P. A. Silver (2004). "A systems view of mRNP biology." Genes Dev 18(23): 2845-60. Hirai, Y., A. Lochter, S. Galosy, S. Koshida, S. Niwa y M. J. Bissell (1998). "Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells." J Cell Biol 140(1): 159-69. Hochbaum, D., T. Tanos, F. Ribeiro-Neto, D. Altschuler y O. A. Coso (2003). "Activation of JNK by Epac is independent of its activity as a Rap guanine nucleotide exchanger." J Biol Chem 278(36): 33738-46. Bibliografía 122 House, A. E. y K. W. Lynch (2006). "An exonic splicing silencer represses spliceosome assembly after ATPdependent exon recognition." Nat Struct Mol Biol 13(10): 937-44. Huang, T. S., C. E. Nilsson, T. Punga y G. Akusjarvi (2002). "Functional inactivation of the SR family of splicing factors during a vaccinia virus infection." EMBO Rep 3(11): 1088-93. Huang, Y., R. Gattoni, J. Stevenin y J. A. Steitz (2003). "SR splicing factors serve as adapter proteins for TAP-dependent mRNA export." Mol Cell 11(3): 837-43. Huang, Y. y J. A. Steitz (2001). "Splicing factors SRp20 and 9G8 promote the nucleocytoplasmic export of mRNA." Mol Cell 7(4): 899-905. Huang, Y. y J. A. Steitz (2005). "SRprises along a Messenger's Journey." Mol Cell 17(5): 613-5. Huang, Y., T. A. Yario y J. A. Steitz (2004). "A molecular link between SR protein dephosphorylation and mRNA export." Proc Natl Acad Sci U S A 101(26): 9666-70. Huh, G. S. y R. O. Hynes (1993). "Elements regulating an alternatively spliced exon of the rat fibronectin gene." Mol Cell Biol 13(9): 5301-14. Huh, G. S. y R. O. Hynes (1994). "Regulation of alternative pre-mRNA splicing by a novel repeated hexanucleotide element." Genes Dev 8(13): 1561-74. Huhtala, P., M. J. Humphries, J. B. McCarthy, P. M. Tremble, Z. Werb y C. H. Damsky (1995). "Cooperative signaling by alpha 5 beta 1 and alpha 4 beta 1 integrins regulates metalloproteinase gene expression in fibroblasts adhering to fibronectin." J Cell Biol 129(3): 867-79. Humphries, M. J., S. K. Akiyama, A. Komoriya, K. Olden y K. M. Yamada (1986). "Identification of an alternatively spliced site in human plasma fibronectin that mediates cell type-specific adhesion." J Cell Biol 103(6 Pt 2): 2637-47. Imagawa, W., V. K. Pedchenko, J. Helber y H. Zhang (2002). "Hormone/growth factor interactions mediating epithelial/stromal communication in mammary gland development and carcinogenesis." J Steroid Biochem Mol Biol 80(2): 213-30. Inoue, T., K. Nabeshima, Y. Shimao y M. Koono (1999). "Hepatocyte growth Factor/Scatter factor (HGF/SF) is a regulator of fibronectin splicing in MDCK cells: comparison between the effects of HGF/SF and TGF-beta1 on fibronectin splicing at the EDA region." Biochem Biophys Res Commun 260(1): 225-31. Inoue, T., K. Nabeshima, Y. Shimao, J. Y. Meng y M. Koono (2001). "Regulation of fibronectin expression and splicing in migrating epithelial cells: migrating MDCK cells produce a lesser amount of, but more active, fibronectin." Biochem Biophys Res Commun 280(5): 1262-8. Jarnagin, W. R., D. C. Rockey, V. E. Koteliansky, S. S. Wang y D. M. Bissell (1994). "Expression of variant fibronectins in wound healing: cellular source and biological activity of the EIIIA segment in rat hepatic fibrogenesis." J Cell Biol 127(6 Pt 2): 2037-48. Kadener, S., P. Cramer, G. Nogués, D. Cazalla, M. de la Mata, J. P. Fededa, S. E. Werbajh, A. Srebrow y A. R. Kornblihtt (2001). "Antagonistic effects of T-Ag and VP16 reveal a role for RNA pol II elongation on alternative splicing." Embo J 20(20): 5759-68. Bibliografía 123 Kadener, S., J. P. Fededa, M. Rosbash y A. R. Kornblihtt (2002). "Regulation of alternative splicing by a transcriptional enhancer through RNA pol II elongation." Proc Natl Acad Sci U S A 99(12): 818590. Kalliampakou, K. I., M. Kalamvoki y P. Mavromara (2005). "Hepatitis C virus (HCV) NS5A protein downregulates HCV IRES-dependent translation." J Gen Virol 86(Pt 4): 1015-25. Kan, Z., E. C. Rouchka, W. R. Gish y D. J. States (2001). "Gene structure prediction and alternative splicing analysis using genomically aligned ESTs." Genome Res 11(5): 889-900. Kanopka, A., O. Muhlemann, S. Petersen-Mahrt, C. Estmer, C. Ohrmalm y G. Akusjarvi (1998). "Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins." Nature 393(6681): 185-7. Karni, R., E. de Stanchina, S. W. Lowe, R. Sinha, D. Mu y A. R. Krainer (2007). "The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene." Nat Struct Mol Biol 14(3): 185-93. Ko, T. K., E. Kelly y J. Pines (2001). "CrkRS: a novel conserved Cdc2-related protein kinase that colocalises with SC35 speckles." J Cell Sci 114(Pt 14): 2591-603. Kohtz, J. D., S. F. Jamison, C. L. Will, P. Zuo, R. Luhrmann, M. A. Garcia-Blanco y J. L. Manley (1994). "Protein-protein interactions and 5'-splice-site recognition in mammalian mRNA precursors." Nature 368(6467): 119-24. König, H., H. Ponta y P. Herrlich (1998). "Coupling of signal transduction to alternative pre-mRNA splicing by a composite splice regulator." Embo J 17(10): 2904-13. Koonin, E. V., N. D. Fedorova, J. D. Jackson, A. R. Jacobs, D. M. Krylov, K. S. Makarova, R. Mazumder, S. L. Mekhedov, A. N. Nikolskaya, B. S. Rao, I. B. Rogozin, S. Smirnov, A. V. Sorokin, A. V. Sverdlov, S. Vasudevan, Y. I. Wolf, J. J. Yin y D. A. Natale (2004). "A comprehensive evolutionary classification of proteins encoded in complete eukaryotic genomes." Genome Biol 5(2): R7. Kornblihtt, A. R. (2006). "Chromatin, transcript elongation and alternative splicing." Nat Struct Mol Biol 13(1): 5-7. Kornblihtt, A. R., M. de la Mata, J. P. Fededa, M. J. Munoz y G. Nogues (2004). "Multiple links between transcription and splicing." Rna 10(10): 1489-98. Kornblihtt, A. R., C. G. Pesce, C. R. Alonso, P. Cramer, A. Srebrow, S. Werbajh y A. F. Muro (1996). "The fibronectin gene as a model for splicing and transcription studies." Faseb J 10(2): 248-57. Kornblihtt, A. R., K. Vibe-Pedersen y F. E. Baralle (1983). "Isolation and characterization of cDNA clones for human and bovine fibronectins." Proc Natl Acad Sci U S A 80(11): 3218-22. Kornblihtt, A. R., K. Vibe-Pedersen y F. E. Baralle (1984). "Human fibronectin: molecular cloning evidence for two mRNA species differing by an internal segment coding for a structural domain." Embo J 3(1): 221-6. Krainer, A. R., G. C. Conway y D. Kozak (1990a). "Purification and characterization of pre-mRNA splicing factor SF2 from HeLa cells." Genes Dev 4(7): 1158-71. Bibliografía 124 Krainer, A. R., G. C. Conway y D. Kozak (1990b). "The essential pre-mRNA splicing factor SF2 influences 5' splice site selection by activating proximal sites." Cell 62(1): 35-42. Krainer, A. R., A. Mayeda, D. Kozak y G. Binns (1991). "Functional expression of cloned human splicing factor SF2: homology to RNA-binding proteins, U1 70K, and Drosophila splicing regulators." Cell 66(2): 383-94. Kuhn, C., 3rd, J. Boldt, T. E. King, Jr., E. Crouch, T. Vartio y J. A. McDonald (1989). "An immunohistochemical study of architectural remodeling and connective tissue synthesis in pulmonary fibrosis." Am Rev Respir Dis 140(6): 1693-703. Kuroyanagi, N., H. Onogi, T. Wakabayashi y M. Hagiwara (1998). "Novel SR-protein-specific kinase, SRPK2, disassembles nuclear speckles." Biochem Biophys Res Commun 242(2): 357-64. Lai, M. C., R. I. Lin, S. Y. Huang, C. W. Tsai y W. Y. Tarn (2000). "A human importin-beta family protein, transportin-SR2, interacts with the phosphorylated RS domain of SR proteins." J Biol Chem 275(11): 7950-7. Lai, M. C., R. I. Lin y W. Y. Tarn (2001). "Transportin-SR2 mediates nuclear import of phosphorylated SR proteins." Proc Natl Acad Sci U S A 98(18): 10154-9. Lamond, A. I. y W. C. Earnshaw (1998). "Structure and function in the nucleus." Science 280(5363): 54753. Lavigueur, A., H. La Branche, A. R. Kornblihtt y B. Chabot (1993). "A splicing enhancer in the human fibronectin alternate ED1 exon interacts with SR proteins and stimulates U2 snRNP binding." Genes Dev 7(12A): 2405-17. Lee, J. A., Y. Xing, D. Nguyen, J. Xie, C. J. Lee y D. L. Black (2007). "Depolarization and CaM kinase IV modulate NMDA receptor splicing through two essential RNA elements." PLoS Biol 5(2): e40. doi:10.1371/journal.pbio.0050040. Lemaire, R., J. Prasad, T. Kashima, J. Gustafson, J. L. Manley y R. Lafyatis (2002). "Stability of a PKCI-1-related mRNA is controlled by the splicing factor ASF/SF2: a novel function for SR proteins." Genes Dev 16(5): 594-607. Lemaire, R., A. Winne, M. Sarkissian y R. Lafyatis (1999). "SF2 and SRp55 regulation of CD45 exon 4 skipping during T cell activation." Eur J Immunol 29(3): 823-37. Li, X., M. E. Shambaugh, F. M. Rottman y J. A. Bokar (2000). "SR proteins Asf/SF2 and 9G8 interact to activate enhancer-dependent intron D splicing of bovine growth hormone pre-mRNA in vitro." Rna 6(12): 1847-58. Liao, Y. F., P. J. Gotwals, V. E. Koteliansky, D. Sheppard y L. Van De Water (2002). "The EIIIA segment of fibronectin is a ligand for integrins alpha 9beta 1 and alpha 4beta 1 providing a novel mechanism for regulating cell adhesion by alternative splicing." J Biol Chem 277(17): 14467-74. Lim, L. P. y P. A. Sharp (1998). "Alternative splicing of the fibronectin EIIIB exon depends on specific TGCATG repeats." Mol Cell Biol 18(7): 3900-6. Bibliografía 125 Lynch, K. W. (2004). "Consequences of regulated pre-mRNA splicing in the immune system." Nat Rev Immunol 4(12): 931-40. Lynch, K. W. y A. Weiss (2000). "A model system for activation-induced alternative splicing of CD45 premRNA in T cells implicates protein kinase C and Ras." Mol Cell Biol 20(1): 70-80. Lynch, K. W. y A. Weiss (2001). "A CD45 polymorphism associated with multiple sclerosis disrupts an exonic splicing silencer." J Biol Chem 276(26): 24341-7. Manabe, R., N. Oh-e y K. Sekiguchi (1999). "Alternatively spliced EDA segment regulates fibronectindependent cell cycle progression and mitogenic signal transduction." J Biol Chem 274(9): 5919-24. Manabe, R., N. Ohe, T. Maeda, T. Fukuda y K. Sekiguchi (1997). "Modulation of cell-adhesive activity of fibronectin by the alternatively spliced EDA segment." J Cell Biol 139(1): 295-307. Maniatis, T. y B. Tasic (2002). "Alternative pre-mRNA splicing and proteome expansion in metazoans." Nature 418(6894): 236-43. Manley, J. L. y R. Tacke (1996). "SR proteins and splicing control." Genes Dev 10(13): 1569-79. Manning, G., D. B. Whyte, R. Martinez, T. Hunter y S. Sudarsanam (2002). "The protein kinase complement of the human genome." Science 298(5600): 1912-34. Mardon, H. J. y G. Sebastio (1992). "Regulation of alternative splicing in the IIICS region of human fibronectin pre-mRNA encoding cell binding sites CS1 and CS5." J Cell Sci 103 ( Pt 2): 423-33. Mardon, H. J., G. Sebastio y F. E. Baralle (1987). "A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene." Nucleic Acids Res 15(19): 7725-33. Matlin, A. J., F. Clark y C. W. Smith (2005). "Understanding alternative splicing: towards a cellular code." Nat Rev Mol Cell Biol 6(5): 386-98. Matter, N., P. Herrlich y H. König (2002). "Signal-dependent regulation of splicing via phosphorylation of Sam68." Nature 420(6916): 691-5. Mayeda, A. y A. R. Krainer (1992). "Regulation of alternative pre-mRNA splicing by hnRNP A1 and splicing factor SF2." Cell 68(2): 365-75. Melton, A. A., J. Jackson, J. Wang y K. W. Lynch (2007). "Combinatorial Control of Signal-Induced Exon Repression by hnRNP L and PSF." Mol Cell Biol 27(19): 6972-84. Mermoud, J. E., P. T. Cohen y A. I. Lamond (1994). "Regulation of mammalian spliceosome assembly by a protein phosphorylation mechanism." EMBO J 13(23): 5679-88. Misteli, T., J. F. Cáceres, J. Q. Clement, A. R. Krainer, M. F. Wilkinson y D. L. Spector (1998). "Serine phosphorylation of SR proteins is required for their recruitment to sites of transcription in vivo." J Cell Biol 143(2): 297-307. Misteli, T. y D. L. Spector (1998). "The cellular organization of gene expression." Curr Opin Cell Biol 10(3): 323-31. Modrek, B., A. Resch, C. Grasso y C. Lee (2001). "Genome-wide detection of alternative splicing in expressed sequences of human genes." Nucleic Acids Res 29(13): 2850-9. Bibliografía 126 Mostafavi-Pour, Z., J. A. Askari, J. D. Whittard y M. J. Humphries (2001). "Identification of a novel heparin-binding site in the alternatively spliced IIICS region of fibronectin: roles of integrins and proteoglycans in cell adhesion to fibronectin splice variants." Matrix Biol 20(1): 63-73. Muro, A. F., M. Caputi, R. Pariyarath, F. Pagani, E. Buratti y F. E. Baralle (1999). "Regulation of fibronectin EDA exon alternative splicing: possible role of RNA secondary structure for enhancer display." Mol Cell Biol 19(4): 2657-71. Muro, A. F., A. K. Chauhan, S. Gajovic, A. Iaconcig, F. Porro, G. Stanta y F. E. Baralle (2003). "Regulated splicing of the fibronectin EDA exon is essential for proper skin wound healing and normal lifespan." J Cell Biol 162(1): 149-60. Ngo, J. C., S. Chakrabarti, J. H. Ding, A. Velazquez-Dones, B. Nolen, B. E. Aubol, J. A. Adams, X. D. Fu y G. Ghosh (2005). "Interplay between SRPK and Clk/Sty kinases in phosphorylation of the splicing factor ASF/SF2 is regulated by a docking motif in ASF/SF2." Mol Cell 20(1): 77-89. Nogués, G., S. Kadener, P. Cramer, D. Bentley y A. R. Kornblihtt (2002). "Transcriptional activators differ in their abilities to control alternative splicing." J Biol Chem 277(45): 43110-4. Nogues, G., S. Kadener, P. Cramer, M. de la Mata, J. P. Fededa, M. Blaustein, A. Srebrow y A. R. Kornblihtt (2003). "Control of alternative pre-mRNA splicing by RNA Pol II elongation: faster is not always better." IUBMB Life 55(4-5): 235-41. Norton, P. A. y R. O. Hynes (1987). "Alternative splicing of chicken fibronectin in embryos and in normal and transformed cells." Mol Cell Biol 7(12): 4297-307. Oliva, J. L., N. Zarich, N. Martinez, R. Jorge, A. Castrillo, M. Azanedo, S. Garcia-Vargas, S. Gutierrez-Eisman, A. Juarranz, L. Bosca, J. S. Gutkind y J. M. Rojas (2004). "The P34G mutation reduces the transforming activity of K-Ras and N-Ras in NIH 3T3 cells but not of H-Ras." J Biol Chem 279(32): 33480-91. Oyama, F., S. Hirohashi, Y. Shimosato, K. Titani y K. Sekiguchi (1989). "Deregulation of alternative splicing of fibronectin pre-mRNA in malignant human liver tumors." J Biol Chem 264(18): 10331-4. Pajares, M. J., T. Ezponda, R. Catena, A. Calvo, R. Pio y L. M. Montuenga (2007). "Alternative splicing: an emerging topic in molecular and clinical oncology." Lancet Oncol 8(4): 349-57. Patel, N. A., C. E. Chalfant, J. E. Watson, J. R. Wyatt, N. M. Dean, D. C. Eichler y D. R. Cooper (2001). "Insulin regulates alternative splicing of protein kinase C beta II through a phosphatidylinositol 3kinase-dependent pathway involving the nuclear serine/arginine-rich splicing factor, SRp40, in skeletal muscle cells." J Biol Chem 276(25): 22648-54. Patel, N. A., S. Kaneko, H. S. Apostolatos, S. S. Bae, J. E. Watson, K. Davidowitz, D. S. Chappell, M. J. Birnbaum, J. Q. Cheng y D. R. Cooper (2005). "Molecular and Genetic Studies Imply Aktmediated Signaling Promotes Protein Kinase C{beta}II Alternative Splicing via Phosphorylation of Serine/Arginine-rich Splicing Factor SRp40." J Biol Chem 280(14): 14302-9. Pelisch, F., M. Blaustein, A. R. Kornblihtt y A. Srebrow (2005). "Cross-talk between signaling pathways regulates alternative splicing: a novel role for JNK." J Biol Chem 280(27): 25461-9. Bibliografía 127 Pelletier, J. y N. Sonenberg (1988). "Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA." Nature 334(6180): 320-5. Petersen, T. E., H. C. Thogersen, K. Skorstengaard, K. Vibe-Pedersen, P. Sahl, L. Sottrup-Jensen y S. Magnusson (1983). "Partial primary structure of bovine plasma fibronectin: three types of internal homology." Proc Natl Acad Sci U S A 80(1): 137-41. Potempa, S. y A. J. Ridley (1998). "Activation of both MAP kinase and phosphatidylinositide 3-kinase by Ras is required for hepatocyte growth factor/scatter factor-induced adherens junction disassembly." Mol Biol Cell 9(8): 2185-200. Prasad, J., K. Colwill, T. Pawson y J. L. Manley (1999). "The protein kinase Clk/Sty directly modulates SR protein activity: both hyper- and hypophosphorylation inhibit splicing." Mol Cell Biol 19(10): 69917000. Pyronnet, S., L. Pradayrol y N. Sonenberg (2005). "Alternative splicing facilitates internal ribosome entry on the ornithine decarboxylase mRNA." Cell Mol Life Sci 62(11): 1267-74. Radisky, D. C., D. D. Levy, L. E. Littlepage, H. Liu, C. M. Nelson, J. E. Fata, D. Leake, E. L. Godden, D. G. Albertson, M. A. Nieto, Z. Werb y M. J. Bissell (2005). "Rac1b and reactive oxygen species mediate MMP-3-induced EMT and genomic instability." Nature 436(7047): 123-7. Recio, J. A. y G. Merlino (2002). "Hepatocyte growth factor/scatter factor activates proliferation in melanoma cells through p38 MAPK, ATF-2 and cyclin D1." Oncogene 21(7): 1000-8. Reed, R. (2000). "Mechanisms of fidelity in pre-mRNA splicing." Curr Opin Cell Biol 12(3): 340-5. Reichmann, E., R. Ball, B. Groner y R. R. Friis (1989). "New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally." J Cell Biol 108(3): 1127-38. Rosario, M. y W. Birchmeier (2003). "How to make tubes: signaling by the Met receptor tyrosine kinase." Trends Cell Biol 13(6): 328-35. Rossi, F., E. Labourier, T. Forne, G. Divita, J. Derancourt, J. F. Riou, E. Antoine, G. Cathala, C. Brunel y J. Tazi (1996). "Specific phosphorylation of SR proteins by mammalian DNA topoisomerase I." Nature 381(6577): 80-2. Roth, M. B., A. M. Zahler y J. A. Stolk (1991). "A conserved family of nuclear phosphoproteins localized to sites of polymerase II transcription." J Cell Biol 115(3): 587-96. Rothrock, C., B. Cannon, B. Hahm y K. W. Lynch (2003). "A conserved signal-responsive sequence mediates activation-induced alternative splicing of CD45." Mol Cell 12(5): 1317-24. Rothrock, C. R., A. E. House y K. W. Lynch (2005). "HnRNP L represses exon splicing via a regulated exonic splicing silencer." Embo J 24(15): 2792-802. Ruskin, B., P. D. Zamore y M. R. Green (1988). "A factor, U2AF, is required for U2 snRNP binding and splicing complex assembly." Cell 52(2): 207-19. Saito, S., N. Yamaji, K. Yasunaga, T. Saito, S. Matsumoto, M. Katoh, S. Kobayashi y Y. Masuho (1999). "The fibronectin extra domain A activates matrix metalloproteinase gene expression by an interleukin-1-dependent mechanism." J Biol Chem 274(43): 30756-63. Bibliografía 128 Sambrook, J. y D. W. Russell (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Sanford, J. R., J. Ellis, D. Cazalla y J. F. Caceres (2005). "Reversible phosphorylation differentially affects nuclear and cytoplasmic functions of splicing factor 2/alternative splicing factor." Proc Natl Acad Sci U S A 102: 15042-47. Sanford, J. R., N. K. Gray, K. Beckmann y J. F. Caceres (2004). "A novel role for shuttling SR proteins in mRNA translation." Genes Dev 18(7): 755-68. Sarkissian, M., A. Winne y R. Lafyatis (1996). "The mammalian homolog of suppressor-of-white-apricot regulates alternative mRNA splicing of CD45 exon 4 and fibronectin IIICS." J Biol Chem 271(49): 31106-14. Sciabica, K. S., Q. J. Dai y R. M. Sandri-Goldin (2003). "ICP27 interacts with SRPK1 to mediate HSV splicing inhibition by altering SR protein phosphorylation." EMBO J 22(7): 1608-19. Schmidhauser, C., M. J. Bissell, C. A. Myers y G. F. Casperson (1990). "Extracellular matrix and hormones transcriptionally regulate bovine beta-casein 5' sequences in stably transfected mouse mammary cells." Proc Natl Acad Sci U S A 87(23): 9118-22. Schwarzbauer, J. E., C. S. Spencer y C. L. Wilson (1989). "Selective secretion of alternatively spliced fibronectin variants." J Cell Biol 109(6 Pt 2): 3445-53. Schwarzbauer, J. E., J. W. Tamkun, I. R. Lemischka y R. O. Hynes (1983). "Three different fibronectin mRNAs arise by alternative splicing within the coding region." Cell 35(2 Pt 1): 421-31. Sebolt-Leopold, J. S. y J. M. English (2006). "Mechanisms of drug inhibition of signalling molecules." Nature 441(7092): 457-62. Serini, G., M. L. Bochaton-Piallat, P. Ropraz, A. Geinoz, L. Borsi, L. Zardi y G. Gabbiani (1998). "The fibronectin domain ED-A is crucial for myofibroblastic phenotype induction by transforming growth factor-beta1." J Cell Biol 142(3): 873-81. Sharp, P. A. (1994). "Split genes and RNA splicing." Cell 77(6): 805-15. Shen, H. y M. R. Green (2006). "RS domains contact splicing signals and promote splicing by a common mechanism in yeast through humans." Genes Dev 20(13): 1755-65. Shen, H., J. L. Kan y M. R. Green (2004). "Arginine-serine-rich domains bound at splicing enhancers contact the branchpoint to promote prespliceosome assembly." Mol Cell 13(3): 367-76. Shimao, Y., K. Nabeshima, T. Inoue y M. Koono (1999). "Role of fibroblasts in HGF/SF-induced cohort migration of human colorectal carcinoma cells: fibroblasts stimulate migration associated with increased fibronectin production via upregulated TGF-beta1." Int J Cancer 82(3): 449-58. Shin, C., Y. Feng y J. L. Manley (2004). "Dephosphorylated SRp38 acts as a splicing repressor in response to heat shock." Nature 427(6974): 553-8. Shin, C., F. E. Kleiman y J. L. Manley (2005). "Multiple properties of the splicing repressor SRp38 distinguish it from typical SR proteins." Mol Cell Biol 25(18): 8334-43. Bibliografía 129 Shin, C. y J. L. Manley (2004). "Cell signalling and the control of pre-mRNA splicing." Nat Rev Mol Cell Biol 5(9): 727-38. Singh, A., A. E. Karnoub, T. R. Palmby, E. Lengyel, J. Sondek y C. J. Der (2004). "Rac1b, a tumor associated, constitutively active Rac1 splice variant, promotes cellular transformation." Oncogene 23(58): 9369-80. Singh, R., J. Valcarcel y M. R. Green (1995). "Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins." Science 268(5214): 1173-6. Smith, C. W. y J. Valcarcel (2000). "Alternative pre-mRNA splicing: the logic of combinatorial control." Trends Biochem Sci 25(8): 381-8. Smith, M. A., G. R. Fanger, L. T. O'Connor, P. Bridle y R. A. Maue (1997). "Selective regulation of agrin mRNA induction and alternative splicing in PC12 cells by Ras-dependent actions of nerve growth factor." J Biol Chem 272(25): 15675-81. Smith, P. J., C. Zhang, J. Wang, S. L. Chew, M. Q. Zhang y A. R. Krainer (2006). "An increased specificity score matrix for the prediction of SF2/ASF-specific exonic splicing enhancers." Hum Mol Genet 15(16): 2490-508. Srebrow, A., M. Blaustein y A. R. Kornblihtt (2002). "Regulation of fibronectin alternative splicing by a basement membrane-like extracellular matrix." FEBS Lett 514(2-3): 285-9. Srebrow, A. y A. R. Kornblihtt (2006). "The connection between splicing and cancer." J Cell Sci 119(Pt 13): 2635-41. Staley, J. P. y C. Guthrie (1998). "Mechanical devices of the spliceosome: motors, clocks, springs, and things." Cell 92(3): 315-26. Stamm, S. (2002). "Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome." Hum Mol Genet 11(20): 2409-16. Swartz, J. E., Y. C. Bor, Y. Misawa, D. Rekosh y M. L. Hammarskjold (2007). "The shuttling SR protein 9G8 plays a role in translation of unspliced mRNA containing a constitutive transport element." J Biol Chem 282(27): 19844-53. Tacke, R. y J. L. Manley (1995). "The human splicing factors ASF/SF2 and SC35 possess distinct, functionally significant RNA binding specificities." Embo J 14(14): 3540-51. Tacke, R. y J. L. Manley (1999). "Determinants of SR protein specificity." Curr Opin Cell Biol 11(3): 35862. Tacke, R., M. Tohyama, S. Ogawa y J. L. Manley (1998). "Human Tra2 proteins are sequence-specific activators of pre-mRNA splicing." Cell 93(1): 139-48. Tarn, W. Y. y J. A. Steitz (1996). "A novel spliceosome containing U11, U12, and U5 snRNPs excises a minor class (AT-AC) intron in vitro." Cell 84(5): 801-11. Tavian, D., G. De Petro, M. Colombi, N. Portolani, S. M. Giulini, R. Gardella y S. Barlati (1994). "RT-PCR detection of fibronectin EDA+ and EDB+ mRNA isoforms: molecular markers for hepatocellular carcinoma." Int J Cancer 56(6): 820-5. Bibliografía 130 ten Dam, G. B., C. F. Zilch, D. Wallace, B. Wieringa, P. C. Beverley, L. G. Poels y G. R. Screaton (2000). "Regulation of alternative splicing of CD45 by antagonistic effects of SR protein splicing factors." J Immunol 164(10): 5287-95. Thornton, J. K., C. Dalgleish, J. P. Venables, K. A. Sergeant, I. E. Ehrmann, X. Lu, P. T. Saunders y D. J. Elliott (2006). "The tumour-suppressor protein ASPP1 is nuclear in human germ cells and can modulate ratios of CD44 exon V5 spliced isoforms in vivo." Oncogene 25(22): 3104-12. Tian, M. y T. Maniatis (1992). "Positive control of pre-mRNA splicing in vitro." Science 256(5054): 23740. Ule, J. y R. B. Darnell (2006). "RNA binding proteins and the regulation of neuronal synaptic plasticity." Curr Opin Neurobiol 16(1): 102-10. Ule, J., A. Ule, J. Spencer, A. Williams, J. S. Hu, M. Cline, H. Wang, T. Clark, C. Fraser, M. Ruggiu, B. R. Zeeberg, D. Kane, J. N. Weinstein, J. Blume y R. B. Darnell (2005). "Nova regulates brain-specific splicing to shape the synapse." Nat Genet 37(8): 844-52. Vagner, S., B. Galy y S. Pyronnet (2001). "Irresistible IRES. Attracting the translation machinery to internal ribosome entry sites." EMBO Rep 2(10): 893-8. van der Houven van Oordt, W., M. T. Diaz-Meco, J. Lozano, A. R. Krainer, J. Moscat y J. F. Caceres (2000). "The MKK(3/6)-p38-signaling cascade alters the subcellular distribution of hnRNP A1 and modulates alternative splicing regulation." J Cell Biol 149(2): 307-16. Vartio, T., L. Laitinen, O. Narvanen, M. Cutolo, L. E. Thornell, L. Zardi y I. Virtanen (1987). "Differential expression of the ED sequence-containing form of cellular fibronectin in embryonic and adult human tissues." J Cell Sci 88 ( Pt 4): 419-30. Venables, J. P. (2006). "Unbalanced alternative splicing and its significance in cancer." Bioessays 28(4): 37886. Wang, J. y J. L. Manley (1995). "Overexpression of the SR proteins ASF/SF2 and SC35 influences alternative splicing in vivo in diverse ways." Rna 1(3): 335-46. Weg-Remers, S., H. Ponta, P. Herrlich y H. Konig (2001). "Regulation of alternative pre-mRNA splicing by the ERK MAP-kinase pathway." Embo J 20(15): 4194-203. Werbajh, S. E., A. J. Urtreger, L. I. Puricelli, E. S. de Lustig, E. Bal de Kier Joffe y A. R. Kornblihtt (1998). "Downregulation of fibronectin transcription in highly metastatic adenocarcinoma cells." FEBS Lett 440(3): 277-81. Whitmarsh, A. J. y R. J. Davis (2000). "Regulation of transcription factor function by phosphorylation." Cell Mol Life Sci 57(8-9): 1172-83. Will, C. L. y R. Luhrmann (2001). "Spliceosomal UsnRNP biogenesis, structure and function." Curr Opin Cell Biol 13(3): 290-301. Wu, J. Y. y T. Maniatis (1993). "Specific interactions between proteins implicated in splice site selection and regulated alternative splicing." Cell 75(6): 1061-70. Bibliografía 131 Xiao, S. H. y J. L. Manley (1997). "Phosphorylation of the ASF/SF2 RS domain affects both protein-protein and protein-RNA interactions and is necessary for splicing." Genes Dev 11(3): 334-44. Xiao, S. H. y J. L. Manley (1998). "Phosphorylation-dephosphorylation differentially affects activities of splicing factor ASF/SF2." Embo J 17(21): 6359-67. Xie, J., J. A. Lee, T. L. Kress, K. L. Mowry y D. L. Black (2003). "Protein kinase A phosphorylation modulates transport of the polypyrimidine tract-binding protein." Proc Natl Acad Sci U S A 100(15): 8776-81. Yaman, I., J. Fernandez, H. Liu, M. Caprara, A. A. Komar, A. E. Koromilas, L. Zhou, M. D. Snider, D. Scheuner, R. J. Kaufman y M. Hatzoglou (2003). "The zipper model of translational control: a small upstream ORF is the switch that controls structural remodeling of an mRNA leader." Cell 113(4): 519-31. Yang, C. H., A. Murti, S. R. Pfeffer, J. G. Kim, D. B. Donner y L. M. Pfeffer (2001). "Interferon alpha /beta promotes cell survival by activating nuclear factor kappa B through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt." J Biol Chem 276(17): 13756-61. Zahler, A. M., W. S. Lane, J. A. Stolk y M. B. Roth (1992). "SR proteins: a conserved family of pre-mRNA splicing factors." Genes Dev 6(5): 837-47. Zahler, A. M., K. M. Neugebauer, W. S. Lane y M. B. Roth (1993). "Distinct functions of SR proteins in alternative pre-mRNA splicing." Science 260(5105): 219-22. Zardi, L., B. Carnemolla, A. Siri, T. E. Petersen, G. Paolella, G. Sebastio y F. E. Baralle (1987). "Transformed human cells produce a new fibronectin isoform by preferential alternative splicing of a previously unobserved exon." Embo J 6(8): 2337-42. Zhang, Y., M. E. Devries y J. Skolnick (2006). "Structure modeling of all identified G protein-coupled receptors in the human genome." PLoS Comput Biol 2(2): e13. Zhang, Z. y A. R. Krainer (2004). "Involvement of SR proteins in mRNA surveillance." Mol Cell 16(4): 597-607. Zhao, J. J., O. V. Gjoerup, R. R. Subramanian, Y. Cheng, W. Chen, T. M. Roberts y W. C. Hahn (2003). "Human mammary epithelial cell transformation through the activation of phosphatidylinositol 3kinase." Cancer Cell 3(5): 483-95. Zhou, Y. Q., C. He, Y. Q. Chen, D. Wang y M. H. Wang (2003). "Altered expression of the RON receptor tyrosine kinase in primary human colorectal adenocarcinomas: generation of different splicing RON variants and their oncogenic potential." Oncogene 22(2): 186-97. Bibliografía 132