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MÉTODO RADIOLÓGICO PARA EVALUAR LA MOTILIDAD GASTROINTESTINAL EMPLEANDO RATONES NO ANESTESIADOS TOSO1, Ricardo E.; BOERIS 1, Mónica A.; LEON 2, Luis 1 Centro de Investigación y Desarrollo de Fármacos (CIDEF). Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Pampa, Calle 116 y 5, General Pico, La Pampa, CP 6360, Argentina 2 University of Applied Sciences, Am Krümpel 31, 49090 Osnabrück, Alemania Correspondencia: [email protected] RESUMEN Se describe un modelo experimental para evaluar la acción de drogas o formulaciones medicamentosas sobre el tránsito gastrointestinal en ratones. El modelo consiste en administrar a ratones las sustancias a ensayar y posteriormente suministrar per os una solución de sulfato de bario. A continuación, o l s animales se inmovilizan en jaulas individuales para tomar radiografías seriadas. Observando el progreso de la sustancia radiopaca en el tracto gastrointestinal puede evaluarse comparativamente la acción de las drogas ensayadas con respecto a drogas de referencia y al grupo control. Examinando las placas radiográficas se puede cuantificar el tiempo de vaciado gástrico así como el tiempo de evacuación intestinal de la sustancia radiopaca y si el mismo depende de las drogas administradas. De la misma forma puede estimarse la velocidad del tránsito gastrointestinal midiendo el tiempo desde la administración de la sustancia radiopaca hasta el comienzo de la evacuación. Este modelo experimental tiene ventajas sobre otros métodos con animales vivos, ya que es incruento y económicamente factible al no requerirse para las pruebas material y equipamiento específico y costoso. Por otro lado es un método de análisis rápido en su ejecución y en la lectura de resultados y que permite adicionalmente la reutilización de los animales luego de un periodo de reposo. El reducido tamaño corporal de los ratones permite evaluar varias drogas al mismo tiempo radiografiando varios grupos de animales en una sola placa. Se concluye que este modelo in vivo no es invasivo, que no requiere anestesiar a ratones y que ahorra sensiblemente el número de animales de laboratorio necesarios para realizar estudios de farmacología experimental. INTRODUCCIÓN Para evaluar el efecto de drogas sobre la motilidad gastrointestinal se pueden utilizan diferentes modelos experimentales. Todos tienen ventajas y desventajas en su preparación y ejecución. En este trabajo se analizan los más comunes y se describe un nuevo protocolo de trabajo. El baño de órganos o también llamado estudio sobre músculo aislado viene siendo utilizado desde hace décadas (Cejalvo Lapeña et al., 1989). Aún 1 en la actualidad se emplea como un método de elección in vitro para obtener información cuantificada sobre la acción de drogas en el aparato gastrointestinal (Zanolari et al., 2007; Nürnberg & Leon, 2008; Aydin et al., 2009; Jeong et al., 2009), reproductor (Ocal et al., 2004) o circulatorio (MoránPinzón et al., 2008). El baño de órganos se emplea en diferentes especies, en la determi nación de la actividad de drogas sintéticas, en el estudio de fármacos fitoterapéuticos (Nürnberg & Leon, 2008; Leon et al., 2008), de carácter etnobotánico (Gilani et al., 2007; Ghayur et al. 2007), en la determinación del efecto de diferentes fases biológicas sobre la actividad del músculo liso (Hirsbrunner et al.; 2002) e incluso en el efecto de algas sobre la motilidad gastrointestinal (Pérez Gutiérrez & Vargas Solís, 2007). Su ventaja es la posibilidad de determinación de dosis de acción eliminando las respuestas de carácter reflejo neuronal (Gual, 1992). Como se mencionó, estos estudios sobre músculo aislado sugieren, pero no predicen el efecto que provocan las drogas cuando se administran en los animales, haciendo necesario los ensayos in vivo (Firpo et al., 2005). Para visualizar el progreso del contenido gastrointestinal, se comenzaron a utilizar sustancias no irritantes de la mucosa intestinal de los animales de experimentación y que puedan visualizarse a simple vista a través de la pared intestinal, por ejemplo carbón (Jannsen & Jageneau, 1957). Generalmente se utilizan ratas o ratones a los cuales se les administra carbón vegetal activo por vía oral utilizando una sonda gástrica. Es unos de los métodos más utilizados en la actualidad para evaluar la actividad motora gastrointestinal in vivo (Agbaje, 2009). También se utilizan con la misma finalidad en reemplazo del carbón otros indicadores como el azul de evans (Sánchez et al., 2005; Lugowska-Umer et al., 2008). Como desventaja, los métodos que utilizan sustancias indicadoras requieren sacrificar a los animales para evaluar el progreso del contenido gastrointestinal. De esta manera se requiere el empleo de un considerable número de animales para evaluar cada droga. Para reducir el estrés y el número de animales utilizados se ha propuesto utilizar ratones con ayunos de cortos períodos de tiempo, 3 horas, y evitar el sacrificio estimando el tránsito intestinal midiendo el tiempo desde la administración oral hasta el comienzo de la evacuación de heces con carbón (Nunes Marona & Bastos Luchesi, 2004). Se han utilizado sustancias radioactivas como indicadores, ya en el año 133 1979, Purdon y Bass administraron una suspensión de Ba SO4 en ratas para evaluar la radioactividad en distintos segmentos estimando de esa forma la velocidad de desplazamiento del contenido gastrointestinal. El empleo de radio nucleótidos se continúa utilizando (Tsopelas et al., 2008). Esta técnica requiere sacrificar a los animales, abrir la cavidad abdominal y ligar distintas secciones del tracto gastrointestinal. Como ventaja se obtiene una lectura más precisa del progreso de la sustancia radioactiva en cada sección, ya que ésta, como consecuencia de los movimientos peristálticos se va mezclando con el resto del contenido. Este grado de precisión no puede lograrse con las sustancias colorantes donde el progreso se evalúa a simple vista o con ayuda de una lupa. De este modo sólo se observan las porciones de intestino que contienen carbón pero sin determinar la concentración de éste. Esta particularidad 2 representa un problema cuando se quieren estudiar alteraciones peristálticas. Como desventaja obliga a manejar sustancias radioactivas y además se necesitan los equipos de medición aumentando el costo. Del mismo modo que se indicó para el método del carbón requiere un gran número de animales para evaluar cada droga. También puede citarse el método empleado por Plaza et al. (1996) que consiste en insertar electrodos para medir las contracciones gastrointestinales. Las ratas deben ser sometidas a una intervención quirúrgica para insertar los electrodos que se conectan a un registrador. El método es muy invasivo y los animales necesitan cuidados para evitar que intenten sacarse los electrodos. En otras fuentes se cita la medición EFS (electric field stimulation) para determinar la actividad muscular (Tung & Borderies, 1992). Los métodos descritos requieren el sacrificio de los animales, ya sea para extraer una sección de intestino para estudios de músculo aislado, o para realizar la lectura de los resultados. Los métodos que realizan lecturas de distintos parámetros gastrointestinales por inserción de electrodos requieren una cirugía previa. Sin embargo puede recurrirse a métodos no invasivos como la observación por medio de rayos x. Extrañamente, mientras que este método de diagnóstico es esencial en gastroenterología humana, rara vez es utilizado en animales de experimentación (Cabezos et al., 2008). Algunos autores utilizaron rayos x en ratas para estudiar las dilataciones en el tracto digestivo que se producen en ratas infectadas con Tripanosoma cruzi (Guillén Pernía et al., 2001). Siracov et al. (2005) utilizaron un método radiológico para evaluar los efectos de la etosuccimida en ratas anestesiadas. Estos estudios permitieron determinar que la atonía gastrointestinal y los disturbios peristálticos pueden ser suprimidos por el uso de metilsulfato de neostigmina. Para tomar las radiografías estos autores inmovilizaron a los animales anestesiándolos con éter. Este procedimiento debió repetirse ocho veces en un plazo de 28 h para obtener los resultados. Los trabajos mencionados utilizando rayos x representaron un progreso en la investigación de drogas con efectos sobre la actividad gastrointestinal in vivo (X. Wang et al., 2007). Sin embargo, anestésicos inhalatorios como el isoflorane (Torjman et al., 2005) o anestésicos fijos como propofol y tribromoetanol (Sababi & Bengtsson, 2001) utilizados para inmovilizar a los animales pueden en algunos casos interferir la acción de las drogas. Cabezos et al. (2008) utilizaron radiología para determinar los efectos del cisplastino sobre la motilidad gastrointestinal. Estos autores introducen una modificación al método que consistió en utilizar ratas no anestesiadas, las cuales podían entrenarse para que ingresaran en las jaulas de plástico que las mantenían inmovilizadas durante aproximadamente cinco minutos. Tiempo suficiente para tomar la radiografía. Además redujeron el tiempo de exposición a 60 ms para evitar que los movimientos espontáneos de los animales alteren la imagen. En trabajos realizados para evaluar el efecto del estrés inducido por hipotermia e inmovilización sobre la mucosa gástrica se determinó que la hipotermia produce una serie de trastornos gástricos que se evidencian con 3 una disminución del flujo sanguíneo mucosal, un aumento de la viscosidad de la sangre y de la motilidad gástrica (Murakami et al., 1985). Estos autores indicaron que el estrés es producido por la hipotermia y no por la inmovilización. De acuerdo con estos estudios las ratas que permanecen en jaulas de inmovilización durante períodos de 7,30 h no sufren alteraciones en la mucosa gástrica. De acuerdo con estos antecedentes se describe en este trabajo un método radiológico utilizando ratones como animales de experimentación y manteniéndolos conscientes en a j ulas individuales de inmovilización durante todo el ensayo. OBJETIVOS Diseñar un método radiológico no invasivo , económicamente viable como método screening para evaluar la acción in vivo de drogas sobre el tránsito gastrointestinal que permita analizar simultáneamente varias drogas al mismo tiempo. Utilizar métodos de contención para los animales que eviten el uso de anestésicos que puedan interferir con la acción de las drogas. MODELO EXPERIMENTAL El modelo consiste en formar grupos homogéneos de rato nes. El grupo testigo o control recibe por las mismas vías con un volumen igual los excipientes empleados para diluir las drogas control y las drogas a ensayar. Se puede emplear a su vez un grupo cero sin ningún tipo de tratamiento. Se utilizan grupos control positivo y/o negativo según se considere necesario. En los grupos tratados se administran las drogas a ensayar disueltas en excipientes. Transcurrido el tiempo que los autores consideren necesario para asegurar el inicio de la acción de las drogas, según nuestras investigaciones 30 minutos, se suministra una solución de sulfato de bario per os y se comienzan a tomar radiografías seriadas. El tiempo entre radiografías se estima de una frecuencia de 10 minutos durante el periodo de vaciado gástrico. Una vez que los animales de todos los grupos han completado el vaciado gástrico se toman radiografías cada 30 minutos hasta comprobar que los animales de todos los grupos han comenzado la evacuación de la sustancia radiopaca. MATERIALES Y MÉTODOS Animales de experimentación Se utilizaron ratones hembras de experimentación Mus musculus de 28 30 g de peso y clínicamente sanos. La totalidad de los animales procedían del bioterio de la Universidad Nacional de La Pampa (Argentina). Fueron alimentados ad libitum con una ración balanceada elaborada por la Cooperación, Asociación Cooperativas Argentinas, San Vicente, Buenos Aires, Argentina cuya composición centesimal es: 23 % proteína bruta, 5 % extracto etéreo, 6 % fibra cruda, 10 % minerales totales, 1,3 % calcio, 0,8 % fósforo y 12 4 % tenor máximo de humedad. Los animales permanecieron alojados en jaulas de cría estándar con temperatura ambiental de 18–22 ºC y ciclos de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales fueron sometidos antes de la experimentación a ayuno de 12 horas de alimentos sólidos y 4 horas de líquidos. Tiempos de ayuno semejantes se encuentran frecuentemente en la literatura. Material farmacológico y dosis Drogas de referencia: para comparación del efecto de las drogas que disminuyen la motilidad gastrointestinal: Se administra vía subcutánea 0,05 mg/kg de N-butilbromuro de hiosciamina (Buscapina ® ampollas para inyección de 20 mg/ml, Boehringer Ingelheim Argentina S.A. Avenida del Libertador 7208 Buenos Aires, Argentina). Para comparar efectos de drogas que aumentan la motilidad gastrointestinal se administra vía subcutánea 0,08 mg/kg de metilsulfato de neostigmina (Prostigmin® Ampollas de 0,5 mg/ml, IGN, Argerich 536, Haedo, Provincia de Buenos Aires, Argentina). Las drogas son vehiculizadas en agua destilada estéril hasta un volumen de 0,2 ml totales para la administración subcutánea que se realiza sobre la parrilla costal utilizando una jeringa de 1 cc con aguja de 0,5 x 15 mm. Sustancia radiopaca: con ayuda de una sonda gástrica se administra per os 0,3 ml de una solución de 20 g de sulfato de bario (Gastropaque ´S´® Polvo citratado, Laboratorio Temis - Lostaló S. A., Quintino Bocayuva 1766, Buenos Aires, Argentina) disuelto en 7 ml de agua destilada. Esta dosis y concentración ha sido determinada como la más eficaz por los autores en ensayos previos. Drogas a ensayar: el método permite evaluar el efecto de drogas que se administran tanto por vía subcutánea, intraperitoneal, intramuscular u oral. Para descartar interferencias en los resultados como consecuencia de distintos manejos en los animales o la administración por distintas vías de las drogas de referencia y las drogas a ensayar debe seguirse el siguiente procedimiento. Cuando la dosis de la droga a ensayar se administra por vía oral, los animales pertenecientes a los grupos testigo y control deben recibir una dosis de igual volumen y por la misma vía del excipiente. Del mismo modo, los animales de los grupos tratados deben recibir una dosis por vía subcutánea de igual volumen con el excipiente empleado para vehiculizar la droga de referencia. El volumen total de las drogas a administrar por vía oral no debe exceder los 0,5 ml. Los autores observaron que volúmenes mayores pueden provocar el pasaje a duodeno por exceso de presión en la cavidad gástrica. Inmovilización de los ratones Se utilizan jaulas de plástico individuales de elaboración propia. Las jaulas de 2,5 x 10 cm presentan perforaciones que permiten una adecuada ventilación para alojar a los animales durante todo el ensayo. Instrumentación Se empleó un equipo portátil rayos de rayos x (Fabricado por MGF, Argentina). Como referencia, se sugiere emplear una potencia de 80 Kw, una penetración 15 mA, tiempo de exposición de 0,01 segundos y distancia de foco de 55 cm. La duración total de un ensayo para evaluar el tránsito gastrointestinal puede extenderse hasta 7 – 8 horas. 5 EVALUACIÓN DE RESULTADOS En la figura 1 se muestra ejemplarmente en un mismo animal de cada grupo el progreso de la sustancia radiopaca desde la administración de la misma hasta transcurridos 120 minutos de su administración. En la figura se observa comparativamente el transito gastrointestinal del material radiopaco en el grupo control (Figura 1, imágenes A), en el grupo control con buscapina (Figura 1, imágenes B) y en grupo con neostigmina (Figura 1, imágenes C). En todas las imágenes A, B y C se representan las radiografías seriadas tomadas a un ratón perteneciente cada grupo a los 10, 20, 60, 90 y 120 minutos de aplicado el sulfato de bario. Se presenta en las gráficas un único animal por grupo, los autores indican que los resultados obtenidos en otros ratones de los mismos grupos son análogos. El tiempo de vaciado gástrico se determina con el tiempo en que se tomó la radiografía que confirma que todos los estómagos de los animales del grupo han evacuado en su totalidad la sustancia radiopaca del estómago. Por ejemplo en la Fig. 1 (imágenes A) ocurrió en el grupo control a los 90 minutos (A3) y en la Fig. 1 (imágenes C) a los 60 minutos de comenzado el ensayo (C4). De esta manera pude confirmarse que los animales tratados con neostigmina disminuyeron el tiempo del vaciado gástrico en 30 minutos con respecto a los del grupo control. En tanto que la buscapina (Figura 1, imágenes B) retrasó el vaciado gástrico durante los 120 minutos que duró el ensayo (B5). El tránsito gastrointestinal se determinó tomando el tiempo transcurrido desde la administración de la sustancia radiopaca hasta el tiempo en que se tomó la radiografía donde se confirma que todos los animales de un mismo grupo comenzaron la evacuación. En la Fig 1 (imágenes A) se observa que a los 120 minutos hay indicios que comenzó la evacuación intestinal, mientras que en la Fig. 1 (imágenes C) el animal tratado con neostigmina está comenzando la evacuación a los 90 minutos y es evidente a los 120. En la Fig. 1 (imágenes B) es notorio el escaso progreso del contenido intestinal en el animal tratado con buscapina. En el animal de este grupo se observa un escaso vaciamiento gástrico y lento progreso de la sustancia radiopaca en el tracto intestinal. En el animal perteneciente al grupo neostigmina (Figura 1, imágenes C) puede observarse un rápido vaciamiento gástrico que se completa a los 60 minutos. La evacuación intestinal está por comenzar a los 60 minutos, es más evidente a los 90 minutos. Estas imágenes son consecuencia del aumento del peristaltismo. La imagen tomada a los 120 minutos muestra que para determinar con exactitud el comienzo de la evacuación deberían tomarse más placas radiografías entre los 90 y 120 minutos. 6 Fig: 1: imágenes A1 a A5 Fig: 1: imágenes B1 a B5 Fig: 1: imágenes C1 a C5 10 20 60 90 120 Fig. 1: Radiografías seriadas tomadas a un ratón perteneciente al grupo control (A), al grupo tratado con buscapina (B) y al grupo tratado con neostigmina (C). Las 5 radiografías fueron tomadas en todos los casos a los 10, 20, 60, 90 y 120 minutos de la aplicación de la sustancia radiopaca (1: 10 minutos; 2: 20 minutos, 3: 60 minutos, 4: 90 minutos; 5: 120 minutos). En la parte inferior de las jaulas de inmovilización de las imágenes C se observan dos marcas radiopacas correspondientes a señas empleadas para identificación de los animales 7 DISCUSIÓN El método presentado permite determinar en ratones el efecto antidiarreico/ antiestreñimiento de medicamentos o/ y drogas. La literatura indica que el número de ratones por grupo para realizar pruebas de farmacología experimental varía entre 5 (Akindele & Adeyemi, 2006), 8 (Hernández Perez et al., 1995) y 10. En nuestras investigaciones se formaron grupos homogéneos de 5 ratones ya que esa cantidad es el mínimo exigido, permite aplicar estadísticas y contempla las normas de uso racional de animales de laboratorio. El modelo de rayos x que se describe en este trabajo utiliza un método de lectura de resultados no invasivo, permitiendo realizar un seguimiento visual del progreso de la sustancia radiopaca en el tracto gastrointesinal. Comparativamente, pueden observarse las diferencias entre grupos para evaluar los efectos que producen las drogas. Estas diferencias pueden cuantificarse midiendo el tiempo en que se produce el vaciado gástrico o el comienzo de la evacuación. Podrán emplearse otros métodos más precisos como la tomografía computarizada, siendo esta sin embargo sensiblemente más costosa. Por otro lado, si se cuenta con equipo de radioscopia se puede observar y determinar exactamente el momento en que se toman las radiografías que confirman cada medición. Esto permitiría, en el caso del ejemplo mostrado en la Fig. 2, hacer un seguimiento pasados los 120 minutos hasta determinar el tiempo de vaciado gástrico bajo el efecto de la buscapina. En el caso de la Fig. 3 habría sido posible determinar el momento exacto en que comenzó la evacuación intestinal. En caso contrario, se deben tomar las radiografías en espacios de tiempo cortos, se sugiere cada 10 minutos. Este procedimiento, si bien aumenta el costo del ensayo evita las repeticiones. La permanencia de los animales en las jaulas de inmovilización facilita el manejo y permiten observar si ha comenzado la evacuación ya que se pueden observar en las radiografías deposiciones radiopacas retenidas en las jaulas (Fig. 3). Los autores de este trabajo han observado que los animales que son colocados en las jaulas de inmovilización sólo intentan por unos 2 a 5 minutos buscar una salida y luego se mantienen sin movimiento sin presentar signos de resistencia o estrés manifiesto . Por este motivo la primera radiografía se toma luego que los animales de grupo hayan suprimido sus movimientos. El tiempo que se espera hasta tomar la primera imagen explica por que parte de la sustancia radiopaca se encuentra en la primera porción del intestino delgado en las radiografías tomadas a los 10 minutos (Fig. 1-3). Aunque no puede evaluarse el grado de estrés que produce la inmovilización, pueden tomarse como referencia los trabajos de Murakami et al. (1985). Estos autores demostraron que el método de inducción de úlceras por estrés inducido por hipotermia e inmovilización produce las lesiones como consecuencia de la hipotermia, pero no de la inmovilización. Para confirmar esta conclusión y utilizando la presencia de úlceras gástricas como indicador de estrés, un grupo de ratones fue sometido a inmovili zación durante 12 horas. Estos animales no presentaron lesiones gástricas cuando se evitó la hipotermia. 8 De acuerdo con lo expuesto puede indicarse que el estrés producido por la inmovilización no afecta la motilidad gastrointestinal, ya que en los trabajos de Murakami et al. (1985) se confirmó que la génesis de las lesiones gástricas se debían a dos factores, falla de la circulación mucosal y aumento de la motilidad gástrica. Lo expuesto lleva a pensar que la inmovilización no produce alteraciones significativas sobre la motilidad en tanto se ha demostrado este efecto en animales anestesiados (Sababi & Bengtsson, 2001; Torjman et al., 2005). En nuestros trabajos no observamos la pérdida de ningún animal, ni durante el ensayo, ni tras ser devueltos a su habitáculo tras la finalización del ensayo. Tampoco en los días posteriores a la finalización del ensayo se contabilizaron pérdidas significativas. Una de las ventajas que ofrece el método de rayos x es que los animales luego de un período de descanso de una semana pueden utilizarse nuevamente para repetir ensayos. De esta forma se puede administrar nuevamente a aquellos animales que respondieron en forma errática y descartar errores experimentales de respuestas individuales propias de la idiosincrasia. El empleo de ratones no anestesiados en reemplazo de las ratas utilizadas por Cabezos et al. (2008) facilitan el manejo al momento de colocar los animales en las jaulas de inmovilización. Por otro lado, el reducido tamaño de estos animales en comparación con animales más voluminosos como ratas permite radiografiar varios grupos al mismo tiempo. Nuestras experiencias indican la posibilidad de realizar pruebas simultáneas con 5 lotes a 5 animales por lote. De este modo es posible evaluar rápida y varias drogas en un solo ensayo o día de investigación. CONCLUSIONES El reducido tamaño de los animales de experimentación permite trabajar al mismo tiempo con una cantidad considerable de ratones y evaluar varias drogas a la vez. El método no es invasivo y no requiere el sacrificio de los animales para evaluar resultados. Los animales luego de un período de descanso de una semana pueden reutilizarse para ensayar las mismas u otras drogas. El tiempo entre radiografías puede variarse según las drogas y la cantidad de placas puede disminuirse para reducir costos. El empleo de ratones y las jaulas de inmovilización de práctica construcción facilitan enormemente el manejo de los lotes de animales, evita errores de método y evita el uso de anestésicos y las posibles interferencias de éstos en los ensayos. El método permite evaluar resultados observando el progreso de la sustancia radiopaca, pero además posibilita medir los tiempos de vaciado gástrico y tránsito intestinal pudiendo estimar estadísticamente los resultados. Se concluye que este método es una herramienta que posibilita la valoración semicuantitativa del efecto de drogas sobre el tracto gastrointestinal, de bajo costo, no invasivo y que no requiere el uso de anestésicos ni el sacrificio de los animales para evaluar los resultados. 9 BIBLIOGRAFÍA - Agbaje (2008): Agbaje, E. O. 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